红、蓝光照对大鼠视力早衰和神经网络的影响

万 宇 李战梅 黄 海 黄学文 何艺岚

(南充市中心医院眼科，南充 637000)

光环境与人类的生活息息相关，尤其是随着信息时代的到来，人们对智能手机、平板电脑等设备的依赖程度逐年升高。这些LED屏幕释放的蓝光(400～500) nm不仅对人的视力会产生巨大的危害，眼睛如果长时间接受蓝光的刺激，RPE细胞和感光细胞形态学会发生改变，对光的敏感度会下降[1]，抑制RPE细胞生长，最终会导致血-视网膜屏障功能障碍[2]。另一方面，光环境在精神疾病方面也发挥着重要作用。抑郁、焦虑、绝望被视为较为普遍的心理疾病，造成该疾病的原因有生理、外界压力和性格等，严重的可产生自杀行为。此外，随着近年来对褪黑素分泌研究的不断深入，有关研究也揭示了光环境与精神类疾病之间的关联[3-4]。

在前人研究的基础上，本研究以红、蓝光为刺激光源，按照8 h睡眠/8 h光照刺激/8 h正常光照的生活作息进行时间设置，讨论红蓝光照在1 h和8 h对大鼠视网膜SA-β-Gal阳性细胞个数的影响，探究蓝光刺激在大鼠视网膜衰老过程中的作用，检测红、蓝光照刺激下大鼠脑组织中NO、NOS含量，以及初步探讨相关视神经传导通路诱导相关神经网络的应激反应[5]；通过FSTs研究蓝光刺激后，大鼠在绝望环境状态下的反应，以寻找蓝光刺激对视网膜衰老和在精神类发病过程中的影响。结合日常生活中手机和电脑屏幕的大量使用，是否会对视力及精神产生一定的影响，并分析蓝光照射是如何通过视力影响神经网络。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究对象为50只SPF级健康雄性Wistar大鼠，体质量为160～200 g，购于陆军军医大学动物实验中心，生产许可证号为：SYXK(渝)20170019，实验动物使用许可证号：SYXK(渝)2017-0005，经检验无眼部疾病和精神疾病。大鼠饲养在光照12 h/黑暗12 h周期循环的鼠笼中(60 cm×60 cm×60 cm)，温度、噪声和湿度均符合动物实验室要求范围，自由进食饲料和饮水。适应性喂养1周后将其按照随机数字表进行分组，分别为蓝光照射1 h(B1组)、红光照射1 h(R1组)、蓝光照射8 h(B2组)、红光照射8 h(R2组)和空白对照组(Con组)，用苦味酸标记各组序号。

1.2 材料与仪器

10%水合氯醛购自天津市化学试剂厂；SA-β-Gal染色试剂盒购自碧云天生物技术公司；NO和NOS试剂盒购自南京建成生物研究所；OTC包埋液购自Sigma公司；医用红、蓝光灯管(20 W)购自佛山水之影有限公司；手术器械购自天津医科大学；722S紫外可见光光度计购自上海精科有限公司；SL8台式离心机购自Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1光照实验

将大鼠取出进行光照实验，通过过滤装置将6个荧光灯放置在距离实验大鼠眼睛上方30 cm处，B1、B2蓝光照射组在医用蓝光灯下分别照射1 h和8 h，R1、R2红光照射组在医用红光灯下分别照射1 h和8 h，在所有光照试验中，红/蓝光照脉冲维持在300lx。Con组放置在明暗交替(12 h/12 h)的自然光照下，连续光照刺激12周。

1.3.2强制游泳实验(FSTs)

每天14:00和16:00进行TSTs实验，具体方案为将各实验组大鼠连续2 d在直径30 cm、高45 cm的树脂玻璃桶中进行强制游泳操作：将25 ℃淡水倒入桶中，水深25 cm。第1天让5组实验大鼠游泳15 min，24 h后进行第2次游泳，游泳时间持续15 min。记录第1次游泳前5 min静止不动的总持续时间和第2次游泳静止不动的总持续时间，并记录大鼠静止不动时，头是否靠在水缸壁上。当大鼠处于行为绝望时，第2次游泳测试中不动性增加则证明第1次测试是行为绝望，第2次测试不动性减少是治疗抑郁效果的重要指标之一[6]，因此，两次游泳测试中数据按照比值进行分析，即第2次不动性/第1次不动性(均值±标准差)[7]。

1.3.3生化指标鉴定

各组大鼠用10%水合氯醛麻醉直至无痛觉反应，迅速取出眼球以及2 mm球后视神经，取B、R实验组大鼠眼组织部分RPE细胞进行原代培养，采用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)2次消化分离细胞，以0.125%胰酶消化并传代培养，用免疫组织化学检测角蛋白与S100表达来鉴定RPE细胞。细胞储存于-80 ℃冰箱中，复苏后观察RPE细胞活性。显微观察RPE体外生长状况：初期为圆型,胞壁内充满黑色色素, 1 h后贴壁生长，后经传代复苏后细胞呈圆型、不规则形，细胞折光性强。免疫组织化学检测显示角蛋白与S100均呈强阳性，说明该细胞是RPE细胞,且细胞纯度为100%。冻存细胞复苏后生长旺盛，细胞形态与复苏前相比无区别[8]。取第3代处于对数生长的RPE细胞，经0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化后加10%胎牛血清的DMEM制成3×105个/mL的细胞悬液，接种于24孔培养板，在波长为490 nm处进行吸光值(A值)测定；对眼球组织进行SA-β-Gal免疫组织化学染色，实验步骤按照文献[9]操作；取枕叶(位于小脑之上大脑后端)部分，用预冷的PBS冲洗脑中残血，吸水纸吸干，超声匀浆后加入PBS，所得组织匀浆进行检测，硝酸还原酶法检测NO浓度，比色法检测NOS浓度，实验步骤严格按照说明书操作。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 RPE细胞增殖能力

以时间为横轴，平均吸光值为纵轴绘制细胞生长曲线如图1。对实验大鼠采用蓝、红光和自然光照射8 h，发现各光原对RPE细胞增殖能力存在不同的影响，大鼠经蓝光照射后RPE细胞在第3、4天细胞增殖能力较对照组显著升高(P<0.05)，与红光照射组相比无显著性差异。

图1 红、蓝光照射组和对照组大鼠RPE细胞的增殖生长曲线Fig.1 Grouw curve of RPE cell in red, blue and contral groups

2.2 FSTs结果

图2A为不同光照下，各实验组大鼠在第2次游泳与第1次游泳相比不动性百分比的变化。方差分析发现：与红光照射、对照组相比，蓝光照射大鼠不动百分比显著降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)，而红光照射与对照组相比无显著性差异。图2B表明，与第1次测试结果相比，第2次游泳测试中不同光照刺激下不动性变化的百分比。蓝光光照1 h、8h和对照组相比，8 h蓝光照射组与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)，而1 h蓝光光照处理组与对照组无显著性差异。

图2 第2次游泳实验与第1次游泳实验静止时间比注：与对照组相比，*P<0.05Fig.2 Percentages of change in duration of immobility in the second forced swim test compared to the first swim testNote：compared with control group，* P<0.05

2.3 不同光源照射对生化指标的影响

通过方差检验结果显示：不同时间不同光照对大鼠RPE细胞SA-β-Gal染色阳性细胞数具有统计学差异(P<0.05)。通过检测大鼠脑组织中NO和NOS含量发现，实验组大鼠RPE细胞中SA-β-Gal染色阳性细胞数均显著高于对照组，且差异具有统计学意义(P<0.05)，说明光照刺激可加速RPE细胞的衰老，进而影响视力。其中蓝光照射8 h组与对照组相比，SA-β-Gal染色阳性细胞数显著增加(P<0.01)；与红光相比，蓝光对细胞的衰老作用更加明显；与对照组相比，蓝、红光照8 h的NO含量均明显升高，(P<0.05)，而蓝、红光照1 h与对照组相比，NO的含量无显著性差异；与对照组相比，蓝、红光照刺激后大鼠枕叶中NOS含量均显著升高，其差异具有统计学意义(P<0.05)，其中蓝光照射8 h组的NOS含量与对照组相比具有较大显著差异(P<0.01)。

表1 各组大鼠SA-β-Gal染色阳性细胞个数、NO和NOS指标比较Table 1 Comparison of the number of SA-β-Gal staining positive cells, NO and NOS in each group n=10)

3 讨论

光照作为临床上常用的物理治疗方法，通过发光装置产生不同波长和强度的光线，刺激相关部位的神经和组织，调节血液循环的内分泌，此种物理疗法无副作用，且操作简单。不同强度的光，对实验动物所产生的作用是不同的[10]。蓝光波长短，具有较高的组织穿透能力，蓝光对于光感受器和RPE细胞有相似的损伤形态，已证实RPE细胞是在蓝光波长范围存在视网膜损伤的基本位点，近紫外线产生的自由基氧化应激在视网膜光化学损伤中占有重要作用，该损伤机制同样适应于蓝光[11]。有研究表明，长时间光照诱导小鼠屈光力向近视方向偏移，晶状体变薄，玻璃体腔延长，视网膜形态发生改变，后极部巩膜胶原直径变小。近期研究发现光照强度可能不会影响眼球正常发育，在长时间光照诱导的小鼠近视形成中并不起重要作用[12]。本实验使用红光和蓝光为发光源，探究不同时间不同光照刺激大鼠RPE细胞增殖生长曲线。结果表明，8 h蓝光照射的大鼠RPE细胞在第3、4天细胞数较对照组显著增加(P<0.05)，而与红光照射组相比无显著性差异，说明一定时长的蓝光光照可显著增强RPE细胞的增殖。随着视力的下降，不同波长、强度对小鼠睡眠觉醒行为也会产生相应的影响[13]，睡眠不足影响精神中枢神经网络的传导，大部分抑郁患者或精神病患者都存在睡眠障碍等问题。

细胞的衰老受细胞分裂次数的限制，当分裂次数达到一定的限度，细胞失去合成DNA和有丝分裂的能力，增殖能力丧失，SA-β-Gal作为体内鉴别细胞衰老的标志，其阳性细胞数可能显示该细胞衰老程度[14]，通过改进SA-β-Gal染色法在不同年龄猕猴眼切片中发现衰老细胞随着年龄的增长逐年累积的现象，这为进一步研究体内RPE细胞衰老复制提供了依据[9]。本研究结果发现：光照刺激组大鼠中SA-β-Gal染色阳性细胞数与对照组相比显著增加(P<0.05)，说明光刺激可以加速大鼠细胞RPE衰老。其中与红光相比，蓝光对细胞的衰老作用更加明显(P<0.05)。NO、NOS的含量与视网膜神经细胞凋亡基因有关[15]，视觉信息从视网膜感光器到到达枕叶，即枕叶介导视中枢的传导。本实验采用试剂盒检测大鼠枕叶组织中NO、NOS的含量，研究光照对神经网路的影响。结果表明红、蓝光照可上调大鼠脑组织中NO、NOS含量，刺激了相关视神经传导通路，引起相关神经网络做出应激反应[16]，其具体机制有待后续深入探讨。

视交叉上核通过神经化学参与精神调节，在下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)传导过程中，神经网络参与情感行为和精神病理学变化[17]。本实验采用FSTs法研究红、蓝光照对神经网路的影响，通过分析经光刺激的大鼠在极端环境中的表现，确定刺激条件对大鼠精神网路的影响。研究结果表明，与红光刺激相比，蓝光更容易使大鼠产生绝望的情绪，长时间蓝光照射比短时间蓝光照射更容易使大鼠产生绝望情绪。光线疗法对抑郁症的作用以及利用LED光谱可调且智能化的优点，根据不同场合和时间段的需求，整合出不同维度的光，给人们带去舒适的体验，创造利于身心健康的光环境，从治疗和预防两方面更好控制抑郁症[18]。由此推想，蓝光照射对精神类疾病存在一定影响，并建议人们合理使用电子设备，特别是青少年儿童视力还未完全发育成熟，长时间使用电子设备不仅对视力产生损伤，还会影响神经网络的健康。