草地贪夜蛾过冷却点和结冰点的测定

罗举，俞俊杰，周明好，杨保军，王爱英，刘淑华，唐健*

(1.中国水稻研究所 稻作技术研究与发展中心，浙江 杭州 310006； 2.江苏大学 电子与信息学院，江苏 镇江 212013；3.四川双利合谱科技有限公司，四川 成都 610016)

草地贪夜蛾(SpodopterafrugiperdaJ. E. Smith)属鳞翅目夜蛾科灰翅夜蛾属，是一种重要的农业害虫。草地贪夜蛾起源于美洲大陆，现已扩散至全球100多个国家，具有适生性强、迁飞距离远、繁殖快、食性杂、为害隐蔽、防控难度大等特点[1]。2019年1月，草地贪夜蛾首次入侵我国云南省普洱市江城县，之后快速向我国粮食主产区扩散，截至2019年10月8日，草地贪夜蛾在我国26个省市的1 538个县(市、区)发生，并呈现继续北扩态势[2]。

温度是影响昆虫生长、交配和繁殖的一个关键生态因子，昆虫对温度的适应能力决定其分布和种群动态。近年来，昆虫抗寒性研究中，将过冷却点(supercooling point, SCP)作为一个重要的指标来界定昆虫的耐寒性强弱。虽然有些昆虫种类的大量死亡出现在过冷却点以上的亚致死温度，致使过冷却点不能作为它们存活的低温下限，但其承受过冷却低温能力在昆虫耐寒性强弱中所起的作用是不可否认的，它作为一个相对的抗寒性指标是不容忽视的，它们影响着昆虫的分布与生活策略，是种群存在与发展的重要前提[3-7]。

研究表明，在美国草地贪夜蛾只能在德克萨斯州和佛罗里达州的南部地区越冬，并且各虫态在0 ℃以下均无法长时间存活[1]。目前，草地贪夜蛾作为新入侵我国的重大迁飞性害虫，其在国内的抗寒能力与潜在越冬区域还不明确。张智等[8]利用SUN-Ⅴ型智能过冷却点测定仪对初始虫源为云南普洱冬玉米田的草地贪夜蛾种群进行了抗寒性分析，指出草地贪夜蛾具有较强的抗寒能力，卵和1龄幼虫的抗寒适应力最强。2019年7—10月，本研究以自主研制的30通道过冷却点测定仪对采集于浙江省金华市春玉米田的种群也进行了过冷却点和结冰点分析，并分析了蛹的含水量和脂肪含量在草地贪夜蛾抗寒力分化方面的作用。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

草地贪夜蛾虫源为2019年5月15日采自浙江省金华市东阳玉米研究所内玉米田的高龄幼虫，室内用新鲜玉米茎叶饲养繁殖。本次试验采用该种群F3～F5代试虫，虫态包括卵、1～6龄幼虫、预蛹、雌、雄蛹(1日龄)和雌、雄成虫(1日龄)。饲养条件为温度(29±1)℃，湿度(70±5)%，光周期14 L/10 D。

1.2 试验仪器

低温冰柜(Haier biomedical DW-40W100)，控温范围为-25～-40 ℃。烘箱(BGZ-146)，控温范围为5～250 ℃，上海博讯工业商业有限公司生产。脂肪测定仪(Hanon Sox500)，济南海能仪器股份有限公司生产。30通路过冷却点测定仪和配套软件由中国水稻研究所与江苏大学联合研发(专利申报中)，该仪器可自动采集并以文本格式存储数据，数据采集间隔为0.8 s，精度为0.1 ℃。

1.3 过冷却点和结冰点测定

测定前，收集草地贪夜蛾卵、1～6龄幼虫、预蛹，以及雌、雄蛹和雌、雄成虫，选取发育一致的个体放入带盖的塑料培养皿中，保持一定的湿度，后置入恒温4 ℃冰箱黑暗处理10 h，取出于室温中恢复2 h，待测。各供试虫测定50头以上。

卵和1～2龄幼虫，测定时将感温探头与虫体接触后用保鲜膜把虫体与探头包好，确保两者接触；3龄以上幼虫、蛹和成虫，置于1 mL或1.5 mL离心管中，底部用脱脂棉填塞，将感温探头插入离心管使探头与虫体充分接触。准备工作完成后将其置于低温冰柜进行测试，当温度降到一定值时，昆虫体液开始结冰，此时的温度即为过冷却点，虫体结冰后释放出热量，在温度变化曲线上显示为跳跃峰值，峰值即为结冰点[5]。

1.4 含水量和脂肪含量测定

取日龄一致的雌、雄蛹分别编号。按照1.3节方法测定过冷却点和结冰点。待测定完后，将试虫取出，用万分之一精度的天平称取单蛹质量，记作鲜质量。鲜质量称量后置于烘箱中烘干(60 ℃烘干48 h)至恒质量并称量，记作干质量。蛹的含水量=鲜质量-干质量。将烘干后的蛹用匀浆器磨粉，委托中国水稻研究所农业农村部稻米及制品质量监督检验测试中心专业人员用脂肪测定仪测定脂肪含量。

1.5 数据分析

分析软件和绘图软件采用Jamovi 1.1.7.0(https://www.jamovi.org)和JASP0.11.1.0(https:// www.jamovi.org)。正态性检验采用Shapiro-Wilk法，正态分布数据按x±s表示，非正态分布数据采用中位数(四分位数间距)表示，P<0.05有统计学意义[9-11]。不符合正态分布多组间比较采用多组秩和检验的Kruskal-Wallis法[11-12]，组间两两比较采用Dwass-Steel-Critchlow-Fligner(DSCF)法[13]。

2 结果与分析

2.1 数据正态性检验

首先对各数据进行正态性检验，结果表明，草地贪夜蛾2龄、4龄、5龄和6龄幼虫期的过冷却点和结冰点数据呈正态分布(表1)，而卵、1龄、3龄、预蛹、雌雄蛹和雌雄成虫的数据分布不呈正态分布。雄蛹和雌蛹的脂肪含量S-W值分别为0.972、0.983，P值分别为0.235、0.478，均>0.05，说明检验结果符合正态分布。雄蛹和雌蛹的水分含量S-W值分别为0.916、0.911，P值均<0.001，说明检验结果不符合正态分布。为了更好地反映真实值，后续数据分析采用用于非正态的非参数法进行，即用中位数进行比较分析。

表1 数据Shapiro-Wilk正态性检验

2.2 草地贪夜蛾过冷却点

由图1可以看出，卵的过冷却点中位数最高，为-2.10 ℃，其次为1龄幼虫(-2.50 ℃)；蛹期的过冷却点中位数最低，雌雄蛹分别为-19.00 ℃和-18.30 ℃；3龄、4龄、5龄、6龄、预蛹和成虫的过冷却点中位数分别为-7.65、-7.15、-6.80、-5.70、-6.95、-7.60 ℃。雌、雄蛹与雌、雄蛾间均无显著性差异。

过冷却点Kruskal-Wallis法方差分析结果表明，不同虫态之间存在极显著差异χ2=529，df=11，P<0.01，ε2=0.567。进一步针对草地贪夜蛾有差异的生育期用Dwass-Steel-Critchlow-Fligner(DSCF)法进行成对数据比较分析。结果表明，卵和1龄幼虫没有差异，和其他虫态均有极显著的差异；1龄幼虫只和卵没有差异，和其他虫态均有极显著差异；2龄幼虫和3龄幼虫、雌雄成虫没有差异，和其他虫态均有极显著的差异；3龄幼虫和2龄、

图1 草地贪夜蛾各虫态过冷却点的小提琴图、散点图、箱线图

4龄、预蛹、雌雄成虫没有差异，而和卵、1龄、6龄幼虫、雌雄蛹有极显著差异；4龄幼虫和3龄、5龄、预蛹、雌雄成虫没有差异，和卵、1龄、2龄、6龄幼虫、雌雄蛹有极显著差异；5龄幼虫和3龄、4龄幼虫、预蛹、雌雄成虫没有差异，和卵、1龄、2龄、3龄、6龄幼虫、雌雄蛹有极显著的差异；6龄幼虫和5龄幼虫、预蛹没有显著差异，和其他各虫态呈极显著差异；预蛹和3龄、4龄、5龄幼虫、雌雄成虫没有差异，和卵、1龄、2龄、6龄幼虫、雌雄蛹有极显著差异；雌蛹和雄蛹彼此之间没有显著差异，和其他各个虫态卵、1～6龄幼虫、预蛹、雌雄成虫都存在着极显著差异；雌雄成虫和2龄、3龄、4龄、5龄幼虫、预蛹以及彼此之间没有差异，而和卵、1龄、2龄、6龄幼虫、雌雄蛹有极显著差异。

2.3 草地贪夜蛾结冰点

从图2可以看出，结冰点与过冷却点整体趋势一致，也是雌雄蛹的结冰点最低，其中位数分别为-15.20 ℃和-16.50 ℃；卵和1龄幼虫的结冰点最高，其中位数分别为-1.30 ℃和-1.80 ℃。2～6龄幼虫、预蛹和雌雄蛾的结冰点中位数分别为-8.50、-7.45、-6.20、-5.70、-4.80、-6.05、-6.50、-6.10 ℃。雌、雄蛹和雌、雄蛾间均无显著差异。

图2 草地贪夜蛾各虫态结冰点的小提琴图、散点图和盒形图

过冷却点Kruskal-Wallis法方差分析结果表明，不同虫态之间存在极显著差异χ2=511，df=11，P<0.01，ε2=0.548。进一步针对草地贪夜蛾有差异的生育期的结冰点数据进行Dwass-Steel-Critchlow-Fligner法成对数据比较分析。结果表明，卵和1龄幼虫没有差异，和其他虫态均有极显著的差异；1龄幼虫只和卵没有差异，和其他虫态均有极显著的差异；2龄幼虫和3龄幼虫、雌雄成虫没有差异，和其他虫态均有极显著的差异；3龄幼虫和2龄、4龄、预蛹、雌雄成虫没有差异，而和卵、1龄、6龄幼虫、雌雄蛹有极显著差异；4龄幼虫和3龄、5龄、预蛹、雌雄成虫没有差异，和卵、1龄、2龄、6龄幼虫、雌雄蛹有极显著差异；5龄幼虫和3龄、4龄幼虫、预蛹、雌雄成虫没有差异，和卵、1龄、2龄、3龄、6龄幼虫、雌雄蛹有极显著差异；6龄幼虫和5龄幼虫、预蛹没有显著差异，和其他各虫态呈极显著差异；预蛹和3龄、4龄、5龄幼虫、雌雄成虫没有差异，而和卵、1龄、2龄、6龄幼虫、雌雄蛹有极显著的差异；雌蛹和雄蛹彼此之间没有显著差异，和其他各个虫态卵、1～6龄幼虫、预蛹、雌雄成虫均存在着极显著的差异；雌雄成虫和2～5龄幼虫、预蛹以及彼此之间没有差异，而和卵、1龄、2龄、6龄幼虫、雌雄蛹有极显著差异。

2.4 蛹的脂肪含量和含水量

1、3、6日龄蛹脂肪含量Kruskal-Wallis法方差分析结果表明，不同虫日龄间差异不显著，χ2=4.03，df=2，P=0.134，ε2=0.025 5，其中位数分别为29.50%、29.32%、25.73%(图3中A)。不同日龄蛹的含水量也不存在显著性差异，χ2=3.02，df=2，P=0.211，ε2=0.030 2，其中位数分别为67.78%、68.57%、68.65%(图3中B)。进一步分析发现，蛹的脂肪含量和含水量与过冷却点、结冰点间不存在显著相关性(图4)。

图3 1、3和6日龄草地贪夜蛾蛹的脂肪含量(A)和水分含量(B)

图4 蛹脂肪含量和水分含量与过冷却点和结冰点的相关矩阵图

3 讨论

过冷却点代表昆虫能够存活的生理低温下限，是反映昆虫越冬抗寒性的一个主要指标。过冷却点越低，昆虫抗寒性越强。本文对草地贪夜蛾各虫态的抗寒性测试结果显示，卵的过冷却点和结冰点最高，其次为1龄幼虫，蛹期最低，这说明蛹期是草地贪夜蛾最理想的越冬虫态。

本文发现草地贪夜蛾蛹期抗寒力存在个体差异，频次分布亦不符合正态分布。进一步分析发现，雌雄蛹的过冷却点/结冰点与含水量及脂肪含量无明显相关性。与蛹期相似，卵、1龄、3龄、预蛹、雌雄成虫的数据分布亦不呈正态分布。为了更好地对草地贪夜蛾进行越冬区域划分和预警监测，未来有必要解析草地贪夜蛾的抗寒机理。

张智等[8]研究认为，卵与1～2龄幼虫的过冷却点、结冰点基本在-20 ℃以下，而本试验中卵与1龄幼虫的过冷却点和结冰点在-3 ℃左右；同样，本研究中成虫的过冷却点与结冰点显著高于张智等[8]的测量结果；但在蛹期，两项研究结果相似，过冷却点分别为-16.30 ℃和-17.23 ℃左右。影响昆虫过冷却点和结冰点的因素有很多，如不同地理种群、不同季节的虫源、昆虫本身的生长发育状况、室内和野外种群、不同取食状态，以及不同测定方法[3-4, 6]。2项研究的虫源与测定方法等存在诸多不同。首先是虫源不同，张智等[8]的初始虫源来自于云南夏玉米田，而本实验虫源来源于浙江春玉米田；其次是所选择的降温速率不同，本研究中是采用冰柜制冷，降温速率4～6 ℃·min-1，快于张智[8]研究中的1 ℃·min-1；使用的测量仪器不同，本研究中采用的是自主研发的30通道过冷却点自主测定仪，与常规市场化测定仪相比，具有高通量、温度更灵敏等优点。虽然2项研究结果细节上存在差异，但都明确说明了草地贪夜蛾具有较强的抗寒能力，推测其在我国具有广阔的越冬区域。因此，注意越冬田块草地贪夜蛾的巡查防治，消灭来年的本地虫源就显得尤为重要。