透明质酸在牙膏中的应用

许海燕 王海英 肖小红 毛 华 陈玉娟 谢玲玉

(1.江西诚志日化有限公司，江西 南昌 330013 2.华熙生物科技股份有限公司，山东 济南 250101)

透明质酸(hyaluronic acid，HA)又称玻尿酸，是天然存在于生物体内的糖胺聚糖中的一种，属于酸性黏多糖，由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖为双糖单位重复连接组成的直链大分子多糖， 相对分子量为(10～200)×104Da。透明质酸广泛存在于人体的表皮与真皮之中，填充在细胞间的胞外基质内。人体内多种细胞如上皮细胞、血管内皮细胞、纤维母细胞、神经胶质细胞等都能合成HA并释放到细胞外，其广泛分布在人体各个组成部分，如玻璃体、滑液、软骨、皮肤、脐带、口腔黏膜等[1]，与胶原蛋白、结构蛋白、硫酸软骨素、硫酸皮肤素一起构成基质的主要成分，在人体中发挥着重要作用[2]。

几十年来，各国学者对HA的结构、理化性质和生理功能已有明确的认识，在医药领域和食品领域有着大量应用研究。牙膏的清洁护理作用是预防口腔疾病的重要而有效的手段，提倡通过刷牙并使用合适的牙膏，提高口腔的健康程度。对于常见的口腔问题——牙龈炎，目前辅助减轻牙龈炎症的牙膏，一般配入的活性功效成分的原料，常用的有各种具抑菌作用的提取物、抗纤维蛋白溶酶成分、收敛剂、活血剂等。国内外多项研究表明，透明质酸在口腔领域也具有强大的生理活性：透明质酸具有抗炎和抗感染以及促进牙周组织修复重建和创伤愈合的作用，比如慢性牙周炎患者在机械治疗或牙周手术后，局部辅以HA凝胶可阻止牙周组织的破坏，减轻牙龈炎症，促进牙周组织的恢复[3]；吴亚菲等研究了单独应用HA凝胶治疗菌斑性牙龈炎，HA可以明显地缓解牙龈炎症[4]；高相对分子质量的HA可抑制牙龈上皮细胞、成纤维细胞和淋巴细胞等的增殖，缩短牙周炎的炎症过程，改善病损区状况[3]；在口腔溃疡方面，HA也具有保护黏膜的作用，Nolan等[5]用0.2%的HA凝胶治疗复发性阿弗他溃疡，每日2～3次，可立即减轻症状，促进溃疡愈合。作为牙周结缔组织细胞外基质的重要组成成分的HA，具有调节细胞外基质的水合作用，在临床上发挥着保水和润滑以及调节渗透压等作用，能保护正常细胞免受毒性细胞和自由基等的侵袭，刺激细胞迁移、黏附、增殖和分化[6]，从而达到抗炎和抗水肿作用。

透明质酸还有很好的应用安全性。在全世界范围内，许多国家已经将透明质酸作为食品添加剂应用到食品的制作中。日本制定了明确的食品行业标准，将透明质酸加入到食品添加剂的目录中，并将透明质酸广泛应用于人们日常生活所需的普通食品中，例如以酸奶、果汁、绿茶、碳酸饮料为代表的饮品，以软糖、果冻为代表的休闲食品，还有以沙拉酱、果酱、蜂蜜为代表的调味品等。中、美、韩等国家已将透明质酸应用于食品制作中，2008年5月国家卫生部按照《新资源食品管理办法》发布12号公告，批准透明质酸钠作为新资源食品用作保健食品原料，87%含量的透明质酸每日可食用量小于等于200mg。

因此，关注透明质酸在口腔中的功效作用，研究其在牙膏中的应用很有必要，而且透明质酸的高保湿性也很有利于其在牙膏中的应用。透明质酸分子在水溶液中高度伸展，并相互缠绕连接，形成连续的网状结构，而水分子则在此网络内通过极性键和氢键与透明质酸分子结合，使得透明质酸能吸收和保持其自身质量1000倍的水分[7]。透明质酸的高保湿性能可增强牙膏的保湿作用。目前透明质酸在牙膏中应用研究还不多，本研究探讨其抗炎修复作用的有效性及在牙膏中应用的稳定性。

1 实验部分

1.1 主要实验材料及仪器

透明质酸Biomoist®，华熙生物科技股份有限公司；人牙龈成纤维细胞(HGF-1)，上海纪宁实业公司；DMEM培养基(Gibco)，赛默飞世尔科技；IL-6 ELISA Kit，北京四正柏生物科技有限公司；牙膏用水合硅石，广州市飞雪化工有限公司；牙膏用二水磷酸氢钙，云南天创化工有限公司；牙膏用碳酸钙，广州满庭芳有限公司；甘油，丰益油脂科技有限公司；丙二醇，陶氏化学(中国)有限公司；山梨醇，山东天力有限公司；羧甲基纤维素钠，江苏常熟威怡科技有限公司；卡拉胶，FMC(上海)公司；黄原胶，淄博中轩生化有限公司；月桂醇硫酸酯钠，东明俱进化工有限公司；月桂酰肌氨酸钠，上海奥利化工有限公司；椰油酰基丙基甜菜碱，德国赢创有限公司；糖精钠，天津长捷化工有限公司；三氯蔗糖，安徽金禾实业有限公司；薄荷香精，上海云峰香精香料有限公司；尼泊金甲酯钠，无锡陆氏食品添加剂有限公司；苯氧乙醇，德国舒美有限公司；磷酸二氢钠，国药集团化学试剂有限公司；磷酸氢二钠，国药集团化学试剂有限公司；磷酸，国药集团化学试剂有限公司；透明质酸对照品，华熙生物科技股份有限公司，含量 100.7%；透明质酸酶，华熙生物科技股份有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

倒置显微镜，OLYMPUS，CKX41；超净工作台(SCB-1520)，北京东联哈尔仪器制造有限公司；二氧化碳培养箱，SANYO，MCO-18AIC(UV)；数显恒温水浴锅，金坛市中大仪器厂；酶标仪，BIO-RAD，iMark；0.0001g电子分析天平，梅特勒-托利多XPE204 ；0.01g电子分析天平，上海信衡电子有限公司；牙膏真空制膏机ZG05，江苏华阴成套设备厂；软管焊条封尾机：自制；牙膏软管，上海三樱包装材料有限公司；pH计，梅特勒S400 SevenExcellenceTMpH/mV；恒温培养箱，苏州威尔实验用品有限公司；安捷伦高效液相色谱仪1200，美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 透明质酸对人牙龈细胞炎性因子分泌的影响实验

通过以人牙龈细胞(HGF-1)为模式细胞，通过 LPS 刺激，使其分泌炎性因子，使用对照品及含 Biomoist®的受试样品进行处理，通过定量检测炎性因子的表达，考察透明质酸Biomoist®对炎性因子释放的抑制作用。

LPS 溶液制备：用无血清 DMEM 培养液配制浓度为 50 万单位/mL 的母液，0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃冰箱保存，临用前稀释成 1 万单位/mL 的作用液。

透明质酸Biomoist®受试样品的制备：使用 1 万单位/mL 的 LPS 溶液配制浓度为 0.2%的 Biomoist®溶液，过滤除菌，即为受试样品。

对照品制备：使用不含血清的 DMEM 培养液作为对照品。

将人牙龈细胞(HGF-1)以 5×105个/mL接种于 24 孔板，在 37℃、5% CO2条件下培养 24h，分别加入透明质酸Biomoist®受试样品溶液、LPS 溶液(阳性对照)和对照品溶液(阴性对照)各 1mL，继续培养 24h，用 ELISA 试剂盒检测炎性因子。操作过程按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 透明质酸对人牙龈细胞的创伤修复作用实验

考察透明质酸Biomoist®对牙龈细胞的创伤修复作用。采用体外模拟伤口愈合采用细胞划痕法，它是简便快捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法。在培养皿中培养的单层人牙龈细胞(HGF-1)细胞上，用微量枪头在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后与对照品及含透明质酸Biomoist®的受试样品接触，继续培养细胞至实验设定的时间，拍照观察周边细胞是否生长迁移至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力。

透明质酸Biomoist®受试样品的制备：用不含血清的 DMEM 培养液配制浓度为 0.2%的透明质酸Biomoist®溶液，过滤除菌，即为受试样品。

对照品制备：使用不含血清的 DMEM 培养液作为对照品。

铺板：以 1×105个/mL 的密度将人牙龈细胞(HGF-1)接种于 24 孔板，每孔 1mL，37℃、 5% CO2条件下培养 24h。

划痕：用 10μL枪头垂直方向在细胞内划线，拍照记录划线后细胞分布与形态。

加药：弃去板中液体，分别加入透明质酸Biomoist®受试样品溶液和对照品溶液，每孔 1mL，继续培养 24h、48h 后拍照对比观察。

使用 SPSS 软件进行数据处理，显著性差异的有效值定为*P值<0.05，**P值<0.01 。

1.2.3 透明质酸在牙膏中的应用实验

根据透明质酸的抗炎修复细胞实验结果，将0.45%用量的透明质酸添加入牙膏的基质中，进行牙膏样品制备。

牙膏按磨擦剂的类型分为二氧化硅型、碳酸钙型、磷酸氢钙型，按照一般牙膏配方原则，将透明质酸加入3个体系的牙膏基础配方中，同时加入不同的表面活性剂和防腐剂，观察配方中各原料的配伍稳定性和透明质酸含量稳定性，具体配方如表1含透明质酸Biomoist®的牙膏配方。

(1)液料制备：常温下将功效剂透明质酸Biomoist®、甜味剂、防腐剂加入配方量的水中进行分散溶解后加入真空制膏机中，再计量称取所需保湿剂加入真空制膏机中，开启搅拌器搅拌2min混合均匀。作为液体混合物待用；

(2)粉料制备：按计量称取所需磨擦剂、粘合剂、发泡剂，在2L烧杯中用玻璃棒手工略搅拌1min。作为粉料混合物待用；

(3)液料和粉料混合：将制备好的粉料混合物加入真空制膏机的液料混合物中，搅拌20min；

(4)按计量称取所需芳香剂薄荷香精，加入真空制膏机的混合物中，搅拌10min；

(5)打开制膏机的真空泵开始抽真空，真空度保持在-0.095MPa以上，12min 后关闭真空泵和搅拌器，制膏完成。

(6)灌装样品：膏体从真空制膏机中倒出，手工灌装到牙膏软管中，用自制封尾机封尾。

1.2.4 透明质酸在牙膏中的含量检测实验

采用酶解结合高效液相外标法检测供试品中透明质酸的含量。

色谱条件：色谱柱：Luna NH2(4.6×250mm，5μm)；流动相：0.4mol/L NaH2PO4溶液；流速：0.6ml/min；进样量：20μL；柱温：35℃；检测波长：232nm。

表1 含透明质酸Biomoist®的牙膏配方

酶解缓冲液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)27.4g、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)8.8g置1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得 0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。上述缓冲液稀释40倍后得到酶解缓冲液(5mM/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH=6.0)。

对照品溶液：精密称取透明质酸对照品约 50mg于 50mL容量瓶中，酶解缓冲液溶解并定容至刻度，混匀。取上述溶液 1.0mL置于10mL容量瓶中，加入2mL透明质酸酶，混匀，密封，42℃酶解2h，煮沸2min使酶失活，流动相定容至刻度，0.22μm滤膜过滤，即得对照品溶液。

供试品溶液：精密称取供试品牙膏 1.0g于10mL容量瓶中，酶解缓冲液定容，混匀。取上述溶液1mL加入2mL透明质酸酶，混匀，密封，42℃酶解2h，煮沸2min 使酶失活，流动相定容至10mL，0.22μm 滤膜过滤，即得供试品溶液。

测定：分别取对照品溶液，供试品溶液20μL 进样，以外标法峰面积计算供试品溶液中透明质酸含量。

2 结果与讨论

2.1 透明质酸对人牙龈细胞炎性因子分泌的影响实验结果

以 LPS 刺激人牙龈细胞(HGF-1)产生炎性因子 IL-6，实验结果表明透明质酸Biomoist®对 IL-6 的分泌抑制率达 65.42%，具体结果见表2透明质酸Biomoist®对炎性因子IL-6的影响。从结果可见Biomoist®可有效抑制炎性因子的产生，减少刺激物对口腔组织的伤害。

表2 透明质酸Biomoist®对炎性因子IL-6的影响

2.2 透明质酸对人牙龈细胞创伤修复的实验结果

通过图1可见，使用透明质酸Biomoist®处理受损的人牙龈细胞 48h 后，受损部位几乎完全恢复，细胞增殖率远高于对照组，表明透明质酸Biomoist®可有效修复受损的牙龈细胞，促进口腔组织恢复健康状态。

图1 透明质酸Biomoist®对牙龈细胞的创伤修复作用h

2.3 含透明质酸牙膏的应用实验结果

透明质酸是白色无味固体，有很强的吸湿性，溶于水不溶于有机溶剂。天然透明质酸的双糖单元由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺构成，从图2透明质酸分子结构图可见，D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺之间通过β-1，3糖苷键相连，而双糖单元通过β-1，4糖苷键连接，两种糖均采取β构象，其羟基、羧基、乙酰氨基、羟甲基都处在e键位上，使透明质酸在能量上非常稳定[8]。透明质酸这种稳定的化学性质有利于其在牙膏中的添加，通过对含透明质酸牙膏样品进行理化指标检测，表明即使将牙膏在40℃烘箱中老化90天后，其性质依然很稳定，各项理化指标也是符合GB/T8372-2017牙膏国标的。

图2 透明质酸分子结构图

表3 含透明质酸牙膏的理化指标表

2.4 透明质酸在牙膏中的含量检测实验结果

表4 不同配方类型牙膏中透明质酸含量测试结果

透明质酸在牙膏中的初始加入浓度为0.45%，但是加入牙膏后检测含量略有下降，在不同牙膏中为2.2%～6.7%不等。40℃烘箱90天加速实验显示其降解率在4.76%～9.1%之间。一般认为活性成分在保质期内降解率控制在10%内是可以接受的，目前仅用加速老化实验模拟保质期，具体保质期内透明质酸含量的稳定性还需要进一步在2～3年实际储存条件下研究考察。

3 结论

实验表明0.2%的透明质酸Biomoist® 对 IL-6 的分泌抑制率达 65.42%，透明质酸可有效抑制炎性因子的产生，减少刺激物对口腔组织的伤害；使用透明质酸Biomoist®处理受损的人牙龈细胞48h后，受损部位几乎完全恢复，细胞增殖率远高于对照组，表明透明质酸Biomoist®可有效修复受损的牙龈细胞，促进口腔组织恢复健康状态。通过考察透明质酸在不同pH体系的牙膏配方(碳酸钙型、磷酸氢钙型、二氧化硅型)中的理化指标和含量，表明透明质酸具有良好的配伍稳定性，牙膏的理化性质稳定，透明质酸的含量也没有出现明显下降现象。

生物制剂向日用品应用延伸是未来需要关注的研发方向，研究了透明质酸水溶液对人牙龈细胞的抗炎修复作用，验证了透明质酸在牙膏中的配方稳定性和含量稳定性，为透明质酸这类生物制剂应用于牙膏进行了探索。