建立可量化的体外血小板、牙龈炎生物模型——研究牙膏的功效作用

陈健芬 郭 庆 孙东方 吴文惠 蔡吴凤 任 格

(1.苏州市金茂日用化学品有限公司，江苏 苏州 215341；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306；3.黑龙江省轻工科学研究院，黑龙江 哈尔滨 150010；4.徐州工程学院，江苏 徐州221018)

前言

血小板是一种具有膜结构的血液成分，在血液中发挥作用，主要是靠多种表面受体及存在于血小板中的可溶性介质来进行的。在正常的血液循环过程中，血小板处于稳定的静止状态,当血管壁出现损伤时，通过表面接触和某些凝血因子的作用，血小板转入激活状态，出现凝集现象[1-3]。白芨提取物可通过增强血小板血栓素A2(TXA2)的活性进而增加血栓素B2(TXB2)含量，缩短凝血酶原时间，TXB2含量增多时，血小板凝聚活性越强[4]。白芨提取物还可通过抑制纤维蛋白酶活性从而降低血浆中环磷酸腺苷(cAMP)含量，使血细胞凝集形成人工血栓达到止血效果[5]。因而选择检测血小板聚集率、TXB2含量和cAMP含量3项指标，以评价添加白芨提取物或氨甲环酸的牙膏对牙龈出血的抑制效果。本研究建立可量化的血小板体外生物模型，探索口腔清洁护理产品及原材料对牙龈止血作用的有效性。

炎症是机体组织对内外环境的有害刺激所产生的一种复杂的生理和病理反应。人牙龈上皮细胞(HGECs)为多角形，融合呈典型的“铺路石”外观。免疫细胞化学检测显示，该细胞角蛋白染色阳性，波形丝蛋白染色阴性，证实其为外胚层来源的细胞[6，7]。炎症因子IL-1β具有调节免疫反应，诱导机体产生前列腺素E2、IL-2等炎症介质[8]。炎症因子IL-6可影响淋巴细胞的增殖分化，促进B淋巴细胞产生抗体，有利于机体抗感染，同时还可抑制成骨细胞胶原和非胶原蛋白的合成，作用于破骨细胞的前体而促进骨吸收[9]。抗炎因子IL-10是一种能趋化中性多形核白细胞、T淋巴细胞和单核细胞等免疫细胞的细胞因子，能够明显抑制炎症反应，在牙周炎的免疫反应中起中枢作用[10]。TNF-α是一种肿瘤坏死因子，主要由活化的巨噬细胞、NK细胞和T淋巴细胞产生，由于其缺少靶向性且有严重的副作用目前仅用于局部治疗[11]。上述细胞因子分泌水平的变化，对于研究牙周组织的炎症及免疫耐受性具有非常重要的意义。牙周病原菌内毒素(LPS)是一种由类脂A、核心寡聚糖和O-特异性多糖侧链组成的糖脂类物质，是革兰氏阴性菌外膜的主要成分。可直接作用于牙周组织细胞，刺激单核细胞和巨噬细胞等效应细胞，诱发炎症反应从而引起牙周组织的破坏[12，13]。同时，它也是一种潜在的细胞激活因子，对牙周炎的产生发挥着重要的作用。当前体外炎症模型的细胞大多运用的是RAW264.7巨噬细胞[14]，而对人牙龈上皮细胞(HGECs)研究较少，本研究甄选了口腔中抵御病原微生物入侵的第一道屏障的HGECs为细胞模型，其更加贴切人体口腔粘膜组织结构，更具科学性、安全性及代表性 。

因牙龈炎是由茵斑微生物引起的牙周组织慢性感染疾病，其主要表现上皮和结缔组织的破坏及牙槽骨的丧失[15]。1998年GeorgeHajishengallis等[16]人研究200g左右的大鼠口腔相当于人类成年45～65周岁的口腔环境，因此选用200g的雌性大鼠作为研究对象。常规的大鼠牙龈炎模型使用复合结扎的方式诱导牙龈炎大鼠模型，在结扎后需频繁更换丝线，实验步骤繁琐，耗时耗力[17，18]。本实验摸索出了在构建丝线结扎磨牙牙龈炎大鼠模型时，同时选用牙龈卟啉单胞菌(P.g)和具核梭杆菌(F.n)诱导[19]。以达到更快捷、更安全地建立大鼠牙龈炎模型的目的，通过检测大鼠牙龈指数(GI)、菌斑指数(PI)和牙龈探诊出血指数(BOP)，结合观察X-ray形态指标，再进一步对唾液中免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)以及血浆中细胞因子IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量的检测，从各方面佐证体外HGECs牙龈炎症模型与大鼠体内牙龈炎模型检测结果的一致性。

1 方法与结果

1.1 材料与分析

1.1.1 试剂与仪器

P.gingivalis(ATCC33277)，F.nucleatum(ATCC49256)，HGECs(上海赛齐生物技术公司)；Wistar大鼠、雌性新西兰兔(SPF级，上海杰思捷实验动物有限公司)；二磷酸腺苷(ADP，美国Sigma-Aldrich 公司，批号A2754)，水合氯醛(Chloralhydrate，10%，PH7.2)ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；DMEM高糖培养基，0.25%胰酶，胎牛血清，青霉素和链霉素(美国Gibco 公司)；其他分析纯试剂均采购于国药、生工等国内试剂供应商。

1.1.2 主要试剂的配制

牙膏样品前期处理：分别将白芨Ⅰ号牙膏、白芨Ⅱ号牙膏、阴性对照牙膏、添加氨甲环酸的牙膏四组样品水浴浸提，浸提液过滤后离心取上清液后减压旋蒸(40℃、75转)至最初牙膏体积，置于真空干燥箱中干燥6h，再冷冻干燥得到牙膏的供试样品，供试样品及白芨提取物用0.9%的生理盐水或DMEM培养基复溶(表1)，0.22μm的滤膜过滤,4℃保存备用(1周内用完)。

表1 实验用体外血小板模型的牙膏样品处理浓度

菌液的制备：P.g和 F.n接种于营养肉汤培养基中，在37℃厌氧条件下培养2～5d，挑取平板上单个菌落用无菌PBS(50mmol/L，pH=7.4)配制菌悬液5mL，并调节为0.5麦氏比浊浓度(1x108CFU/mL)，然后加入羧甲基纤维素，用0.22μm孔径的滤膜过滤，配制成含2%羧甲基纤维素的新鲜菌液。

细胞培养：HGECs移至含有10%热灭活牛血清DMEM高糖培养基中，添加1%100μg/mL的青霉素和链霉素，于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养。及时换液并传代培养，取5～6代生长状态呈对数期的细胞进行试验。

表2 主要仪器

1.1.3 统计学分析

应用SPSS17.0软件包分析处理实验数据，采用单因素方差分析和LSD检验比较组间的差异。所有组的数据使用K-S检验正态性，发现数据为正态性分布，使用单因素方差分析对各组相应指标的均数进行显著性检验，并通过LSD检验进行样本均数的两两比较，以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

1.2 建立基于血小板生理变化的体外实验模型

1.2.1 试验方法

采用心脏采血法13收集新西兰雌性大白兔新鲜血液，离心后将血小板密度调整为1×1012/L，按照设计的实验方案检测空白时的吸光度OD0，按照试验的分组情况加入不同的牙膏样品(5ul/well)，轻微震荡。再将该96孔板置于37℃下恒温孵育5分钟，充分反应。随后加入5ul的ADP溶液轻微震荡以诱导血小板聚集，血小板出现聚集反应后，相应体系内的浊度会发生变化。根据酶标仪中的OD值的变化计算血小板聚集率，其计算公式如下。按照ELISA试剂盒说明书检测兔血浆中的cAMP、TXB2含量。

1.2.2 体外兔血小板生物模型中血小板聚集率、TXB2、cAMP含量的结果

采用兔血浆并通过ADP诱导血小板活化，检测样品处理组孵育血小板后的血小板聚集率、血小板生理代谢的主要产物TXB2及生命信息传递信使cAMP，每组重复5次，结果如图1。

样品A：白芨Ⅰ号牙膏；样品B：白芨Ⅱ号牙膏；样品C：阴性对照牙膏；样品D：氨甲环酸牙膏；样品E：白芨提取物。P<0.05用*表示；P<0.01用**表示；P<0.001用***表示。

血小板聚集率是反映血小板凝聚功能的重要指标，是止血功能的最早反应，血小板聚集率增高时则呈现血栓状态[20]。样品A、B、C、D、E处理后稀释为0.05%～0.80%，检测其对ADP诱导的血小板聚集率的影响，其中浓度为0.10%～0.40%的各牙膏样品效果较显著。结果表明：0.20%左右的白芨提取物(E)的血小板聚集率最高，比阴性对照牙膏(C)高出为32.27%±3.07%(P<0.05)。其次是稀释为0.10%的氨甲环酸牙膏(D)，血小板聚集率比阴性对照牙膏高28.96%±2.66%(P<0.05)，白芨Ⅰ号牙膏和白芨Ⅱ号牙膏的血小板聚集率也均有显著性增高(P<0.01)，说明添加有白芨提取物或氨甲环酸的牙膏均有明显的止血效果。

样品A：白芨Ⅰ号牙膏；样品B：白芨Ⅱ号牙膏；样品C：阴性对照牙膏；样品D：氨甲环酸牙膏；样品E：白芨提取物。P<0.05用*表示；P<0.01用**表示；P<0.001用***表示。

TXB2是血小板花生四烯酸代谢途径环氧化酶的主要产物之一，白芨提取物及其牙膏和氨甲环酸牙膏可促进血小板环氧化酶[21]，因此检测白芨提取物及其添加白芨提取物或氨甲环酸牙膏刺激血小板体外模型后血小板分泌TXB2的含量来推断血小板的活性，TXB2含量越高，表示血小板生理活性越活跃。结果表明：稀释为0.40%左右的白芨提取物的效果最为显著，TXB2含量比正常血浆高7.11ng/L±0.22ng/L(P<0.001)；其次氨甲环酸牙膏、白芨Ⅰ号牙膏和白芨Ⅱ号牙膏也能显著性增加血浆中TXB2含量(P<0.01)。

样品A：白芨Ⅰ号牙膏；样品B：白芨Ⅱ号牙膏；样品C：阴性对照牙膏；样品D：氨甲环酸牙膏；样品E：白芨提取物。P<0.05用*表示；P<0.01用**表示；P<0.001用***表示。

在血小板中，cAMP可通过蛋白激酶A有效地刺激膜上的一种蛋白磷酸化，并通过对钙摄入的影响，调节血小板收缩的生理功能[22]，而白芨提取物及其牙膏可抑制蛋白激酶的活化从而影响cAMP分泌，cAMP含量越高表示血小板越呈老化状态[23]。结果表明：0.40%左右的氨甲环酸牙膏组的效果最为显著，cAMP含量比正常血浆低292.53nmol/L±2.32nmol/L(P<0.01)，而白芨提取物、白芨Ⅰ号牙膏与白芨Ⅱ号牙膏组也能显著性减少cAMP含量(P<0.05)。

1.3 体外HGECs牙龈炎模型的细胞因子IL-6、IL-1β、IL-10、TNF-α变化

1.3.1 细胞活性检测

CCK-8试剂可用于检测牙膏样品对HGECs细胞增殖和毒性分析，根据加药后细胞存活率以筛选HGECs的最适牙膏样品浓度值[24]。加入浓度梯度的牙膏样品处理(含10μg/mLLPS)，充分孵育后加入CCK-8试剂，用酶标仪测量550nm处各孔的吸光值，细胞存活率在80%-100%的牙膏样品浓度为对HGECs最安全也是最适宜的处理浓度。

样品A：白芨Ⅰ号牙膏；样品B：白芨Ⅱ号牙膏；样品C：阴性对照牙膏；样品D：氨甲环酸牙膏；样品E：白芨提取物。

CCK-8试剂用于添加白芨提取物或氨甲环酸牙膏最适浓度的筛选，具有灵明度高、细胞毒性小、结果优于MTT等多种优点[25]。结果显示：采用0.5ug/ml样品浓度评价各组牙膏样品的抗炎作用最适(P<0.05)。

1.3.2 HGECs牙龈炎模型中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的检测结果

采用酶联免疫吸附法20检测经LPS诱导，牙膏样品孵育后的HGECs所分泌细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的含量，依IL-6、IL-1β、IL-10、TNF-α的ELISA试剂盒说明书检测。每个实验重复5次，结果如下图。

样品A：白芨Ⅰ号牙膏；样品B：白芨Ⅱ号牙膏；样品C：阴性对照牙膏；样品D：氨甲环酸牙膏；样品E：白芨提取物。P<0.05用*表示；P<0.01用**表示；P<0.001用***表示。

IL-10为抗炎因子，可通过释放免疫介质从而达到抑制炎症作用；IL-1β、IL-6为炎症因子，当机体发生炎症时这两种细胞因子相应增加[18]；TNF-α是一种肿瘤坏死因子，可通过引起一些炎症反应使肿瘤细胞出血性坏死。Control为经LPS诱导后的HGECs炎症模型。结果表明：经氨甲环酸牙膏组处理HGECs分泌的IL-10含量最高，为98.95ng/L±2.42ng/L(P<0.001)；IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子TNF-α含量最低，分别为6.12ng/L±0.02ng/L，6.36ng/L±0.04ng/L(P<0.01)，13.09ng/L±0.01ng/L(P<0.01)；其中白芨提取物、白芨Ⅰ号牙膏和白芨Ⅱ号牙膏对HGECs炎症模型分泌的细胞因子也均表现有显著性差异(P<0.05)。

1.4 建立大鼠牙龈炎模型——验证HGECs体外牙龈炎模型的有效特性

1.4.1 试验方法

SPF级Wistar大鼠共20只，雌性，体重200±20g，活动良好，无龋坏，无牙周病。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5mg/kg麻醉后，选择双侧上颌第二磨牙用5-0医用丝线结扎于牙颈部，结扎丝线尽量放入龈沟内，遇结扎线脱落需重新结扎(图6)。结扎后用10%糖水代替饮水喂养，每隔一天接种一次制备好的菌液0.5ml。建模成功后给试样15d，检测大鼠唾液的免疫球蛋白igG、igM、igA因子(表3)，GI、PI、BOP结果(图7)，大鼠血浆中的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6因子(图8)和X-ray形态学分析(图9)。

图6 大鼠牙龈炎第二磨牙的丝线结扎

1.4.2 试验结果

用酶联免疫吸附法22检测第三、六周大鼠口腔中唾液分泌的免疫球蛋白IgG、IgM及IgA，采用探针检测各组大鼠口腔的牙龈指数，用酶联免疫吸附法检测用药15d的大鼠血浆中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的含量，每组重复3次，结果如表3。

表3 各组大鼠唾液的IgG、IgM、IgA比较

IgA为分泌性的免疫球蛋白A，是机体抵御病原体的第一道免疫防线，有效地阻止口腔中有害物质进入上皮细胞[26]；IgM为免疫球蛋白M，是免疫应答中最早出现的抗体，可根据其含量来评价口腔中牙龈炎的修复作用[27]；IgG是免疫球蛋白G，是血清中主要的抗体成分，唾液中含量极低。对照组(F)为患严重牙龈炎的大鼠模型，空白组(G)为牙龈健康的大鼠。结果表明：氨甲环酸牙膏处理后IgA的变化最为明显，增加了1.18mg/L(P<0.01)；白芨Ⅰ号牙膏处理后IgM增加了410ng/L(P<0.01)；而IgG在第三周大鼠口腔发炎严重时,由于牙龈易出血导致能在口腔唾液中到大量血清中的IgG，但第六周牙膏处理后则恢复正常值。

A：白芨Ⅰ号牙膏组；B：白芨Ⅱ号牙膏组；C：阴性对照牙膏组；D：氨甲环酸牙膏组；E：白芨提取物组；F：对照组；*P<0.01；**P<0.01；***P<0.001

牙龈指数GI通过检查牙龈颜色和质的改变评价口腔的健康情况，菌斑指数PI根据牙面菌斑的厚度评价口腔中牙周病防治效果，牙龈出血指数BOP则是通过探针刺激牙龈部分评价口腔牙龈的病理状况[28,29]。对照组(F)为患牙龈炎的大鼠模型。结果表明：大鼠牙龈炎模型中，白芨提取物处理的大鼠口腔GI、PI、BOP均显著性减少(P<0.001)，其次是白芨牙膏和氨甲环酸牙膏处理组(P<0.01)，表明白芨提取物和添加有白芨提取物或氨甲环酸的牙膏对口腔牙龈炎均有显著的治愈作用。

A：白芨Ⅰ号牙膏组；B：白芨Ⅱ号牙膏组；C：阴性对照牙膏组；D：氨甲环酸牙膏组；E：白芨提取物组；F：对照组；G：空白组。(#P<0.05；##P<0.01；###P<0.001vs.Fgroups；* P<0.01；** P<0.01；***P<0.001vs.Ggroups)

对照组(F)为患严重牙龈炎的大鼠模型，空白组(G)为牙龈健康的大鼠。结果表明：白芨提取物处理组的血浆中IL-10含量最高，为27.98ng/L±1.22ng/L(P<0.05)；IL-1β、IL-6、TNF-α含量最低，分别为12.26ng/L±0.30ng/L(P<0.001)，2.62ng/L±0.01ng/L(P<0.001)，103.99ng/L±4.37ng/L(P<0.001)；添加白芨提取物或氨甲环酸牙膏组对大鼠牙龈炎模型也均有显著性修复效果(P<0.05)。

给试样15d后，大鼠上颌牙周组织的X射线显示牙槽骨影像如图9。

对照组(F)为患有严重牙龈炎的大鼠口腔上颚，由对照组中星号处可观察到明显的銀乳头退缩和炎性细胞浸涧，銀乳头位于釉牙骨质界下方，牙槽帷高度降低，牙槽崎顶到釉牙骨质界的距离显著増加。图9中A、B、D、E是各组牙膏修复后的大鼠牙銀组织，与对照相比，各实验组牙膏处理牙齿排列紧密，牙齿与牙槽贴合紧密，从给试样组星号处可观察到大鼠第二磨牙与相邻磨牙间隙明显减小。而阴性对照牙膏处理组(C)处理的第二磨牙与相邻磨牙间隙与空白组相比变化不明显。结果表明：白芨提取物和添加白芨提取物或氨甲环酸的牙膏可明显改善牙周炎大鼠牙间隙以及牙齿与牙槽缝隙。

A：白芨Ⅰ号牙膏处理组；B：白芨Ⅱ号牙膏处理组；C：阴性对照牙膏组；D：氨甲环酸牙膏处理组；E：白芨提取物处理组；F：对照组☆：牙槽骨吸收；★：牙槽骨修复

2 讨论与结论

2.1 长期以来针对口腔清洁护理产品的此类抗牙龈炎及牙龈出血等功效的的临床评价，存在着成本高、耗时长，对受试者控制难，操作繁琐，且临床测试结果达不到预期等局限性，同时还存在一定的盲目性。因此建立体外血小板、牙龈炎的生物模型，作为未来口腔清洁护理产品及其材料功效作用的研究与评价，具有充分必要性。

2.2 血小板活化是一个自我放大的级联反应。ADP诱导的血小板聚集及凝血因子的检测广泛用于止血药物的评价，其中cAMP和TXB2在该条止血途径发挥主要作用[30]。白芨Ⅰ号牙膏、白芨Ⅱ号牙膏、阴性对照牙膏、氨甲环酸牙膏和白芨提取物稀释为40%时差异极显著(P<0.05)，其血小板聚集率分别是61.64%、61.26%、57.59%、65.56%、75.23%；cAMP含量分别为330.61nmol/L、416.56nmol/L、449.78nmol/L、244.60nmol/L、313.41nmol/L；TXB2含量分别为6.22ng/L、5.88ng/L、5.43ng/L、10.04ng/L、11.36ng/L。研究结果表明在体外血小板生物模型中，体外止血效果依次为：白芨提取物>氨甲环酸牙膏组>白芨Ⅰ号组>白芨Ⅱ号牙膏组>阴性对照牙膏组。同期采用的动物体内实验,以X-ray组织观察、探针出血指数(BOP)、唾液中免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)等含量为评价指标，结果显示牙膏样品在动物体内与体外的血小板生物模型上的止血效果呈正相关性。因此，本研究建立的以血小板生物模型作为未来代替动物体内实验，探索出了新的研究思路与方向，并且验证了未来可运用血小板生物模型作为代替动物体内的牙龈止血实验的可行性。

2.3 通常LPS耐受的研究主要集中于单核/巨噬细胞等免疫细胞。还尚缺乏HGECs免疫耐受的直接报道，Muthukuru的研究已证实，慢性牙周炎患者的牙龈组织中，HGECs能够识别LPS等毒力因子[31,32]，因此研究选择最贴近最外层易感染的HGECs作为研究对象。CCK-8检测显示选择0.5ug/mL的样品浓度检测炎症因子，白芨Ⅰ号牙膏、白芨Ⅱ号牙膏、阴性对照牙膏、氨甲环酸牙膏和白芨提取物对LPS刺激HEGCs细胞上清液中IL-10含量均呈极显著性增加(P<0.001)，IL-6显著性减少(P<0.01)，TNF-α一般性减少(P<0.05)，IL-1β无明显差异。通过比对大鼠血浆中细胞因子IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量及牙龈炎模型探针牙龈诊断(GI、PI)，为验证上述实验样品牙膏对牙龈炎的抑制作用取得了重大突破。研究表明牙膏在动物体内炎症介质和细胞因子的抑制作用与体外HGECs牙龈炎模型的检测结果具有一致性，为未来逐渐淘汰动物体内炎症模型提供了可靠的方法依据。

2.4 目前，我国在针对口腔清洁护理产品(含氟防龋再矿化、除渍美白除外)的体外功效评价模型的建立上，尚缺乏快速、便捷、可靠的方法或手段。研究结果表明，建立体外血小板、牙龈炎的生物模型，通过对酶分子水平和细胞因子表达的考察，并与体内大鼠牙龈炎模型作结果一致性的验证。实现了在较短时间内评价口腔清洁护理用的材料及其产品的功效。从而提升了原材料及其产品功效研究的时效性，大大降低了资金投入成本，更是提供了快捷、高效、可靠且更具安全、科学性的评价手段。同时也为口腔清洁护理用品行业对相关产品的功效验证提出了一种新的思路与途径。此外，通过本研究摸索，为日后进一步深入探究功效材料及其产品对口腔细胞在核酸、蛋白及分子水平方面的作用机制做了铺垫。