威灵仙中5-HMF含量测定及其来源研究

许晨新，赵圆圆，李亚俊，马圆媛，吴梦茹，刘文杰，吴 洁，张海江*

(1. 淮阴工学院 江苏省特色资源开发与药用重点实验室，江苏 淮安 223003；2.潍坊市康华生物技术有限公司，山东 潍坊 2610213；3. 江苏卫生健康职业学院药学院，南京 211800)

威灵仙为毛莨科植物威灵仙ClematidisRadixchinensisOsbeck.、棉团铁线莲ClematidisRadixhexapetalaPall.、东北铁线莲ClematidisRadixmanshuricaRupr.的干燥根及根茎[1]，临床用于风湿痹痛，肢体麻木，筋脉拘挛，屈伸不利。市场上的威灵仙主要产于安徽、东北、朝鲜等地。威灵仙中化学成分复杂[2]，主要包括三萜皂苷、黄酮、香豆素、生物碱等。有研究发现，在东北铁线莲中含有5-羟甲基糠醛(5-HMF)[3-4]。5-HMF是葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的一个醛类化合物，是大多数中药煎煮后或加工炮制后的共性成分[5]。由于该化合物对人体横纹肌和内脏有损害，因此有必要测定其含量进行中药材及其饮片的质量控制[6-10]。本研究基于威灵仙临床水煎的提取方法，研究建立不同产地、基原威灵仙水煎液中5-HMF的HPLC含量测定方法，并探究5-HMF生成机制，以期为威灵仙提取方法的改进提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1100 型高效液相色谱仪(G1379A型脱气机，G1311A型四元泵、G1313A型自动进样器、G1316A型柱温箱、G1315B型DAD检测器)；FA2004型电子天平(上海图新电子科技有限公司)；Q/320683AFA02-2005型调温电热器(上海苏达实验仪器有限公司)；Allegra X-30型多功能台式高速离心机(美国Beckman Coulter公司)；歌能G-100S型超声波清洗机超声清洗仪(深圳市歌能清洗设备有限公司)；JP-100A-2型高速多功能粉粹机(上海市久品工贸有限公司)；TS-DI10-L/H型实验室超纯水机(陶氏水处理设备工程有限公司)。

1.2 试药

威灵仙药材购于安徽亳州药材市场，共计4个产地，6个批次，分别为安徽1批次、辽宁2批次、东北2批次、朝鲜1批次。药材由本实验室鉴别，其中威灵仙1批次，棉团铁线莲1批次，东北铁线莲4批次(见表1)。各药材样品均保存于本实验室；5-HMF对照品购于上海麦克林生化科技有限公司(批号C10076829)，乙腈(色谱纯)，D101型大孔吸附树脂，水为实验室自制超纯水，其他试剂均为分析纯。

表1 中药材威灵仙的来源及基原鉴别

1.3 色谱条件

色谱柱：Venusil XBP C18柱(天津博纳艾杰尔科技有限公司，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈- 0.5%HAC(5.5:94.5，V/V)等度洗脱；流速：1 mL·min-1；检测波长：284 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。

1.4 对照品储备液的制备

精密称取5-HMF对照品105.3 mg，至100 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容，配制成1.053 mg·mL-1的对照品储备溶液。

1.5 供试品制备

1.5.1回流提取

取威灵仙药材粉末(过5号筛)约10 g，精密称定，置250 mL圆底烧瓶中，按照正交试验最佳工艺共提取3次，合并提取液，离心，过滤，至250 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤，得供试品溶液。

1.5.2超声提取

取威灵仙药材粉末(过5号筛)约20 g，置250 mL圆底烧瓶中，加入水溶液200 mL，常温下超声提取，每次30 min，共提取2次，合并提取液，离心，取上清液，得到超声水提液。取适量水提液低温浓缩后，冻干得到超声冻干物。

2 结果与分析

2.1 提取工艺优化

表2 回流提取L9(43)正交试验

表3 回流提取正交试验结果

2.2 方法学考察

2.2.1系统适用性试验

精密吸取对照品储备液、回流提取供试品溶液和超声提取水提液适量，按色谱条件进行HPLC分析。结果表明，5-HMF保留时间为9.27 min，分离度大于1.5；理论板数大于4000。超声提取液中未检测到5-HMF(见图1)。

A:5-HMF对照品；B:威灵仙加热回流供试品；C:威灵仙超声水提供试品；1：5-HMF。

2.2.2线性关系考察

精密吸取对照品储备溶液适量，以水逐级稀释得到21.0530～0.3508 μg· mL-1的对照品系列溶液。按色谱条件分析，以对照品溶液浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，进行线性回归分析，得方程为Y=149.69 X-7.5183，R2=0.9999。结果表明，5-HMF在0.3508 ～ 21.053 μg· mL-1的浓度范围内，峰面积与浓度具有良好的线性关系。

2.2.3检测限与定量限

精密量取对照品储备液适量，逐级稀释后按色谱条件分析，测得检测限为0.09 μg· mL-1，定量限为0.30 μg· mL-1。

2.2.4精密度试验

精密吸取同一对照品储备液20 μL，按色谱条件连续进样6次，测得5-HMF峰面积的RSD为0.16%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.5稳定性试验

取同一供试品溶液(产地安徽)，分别在0、2、4、6、8、10 h按色谱项条件分析，测得峰面积 RSD为1.2%(n=6)，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.2.6重复性试验

取同一批威灵仙样品(产地安徽)，按回流提取制备方法平行6份，按色谱条件分析，记录色谱峰面积， RSD为2.2%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.2.7加样回收率试验

精密称取已知含量威灵仙药材粉末(产地安徽)9份，每份10 g，每3份分别精密加入1 mg· mL-1的

5-HMF溶液1.3 mL、1.6 mL、1.9 mL，按回流提取制备方法制备，平均加样回收率为99.8%，RSD为1.2%(见表4)。

表4 加样回收率试验结果

2.3 5-HMF样品含量测定

各产地的威灵仙药材样品分别按照回流提取方法制备供试品溶液，经色谱条件测定，各产地威灵仙药材中的5-HMF含量结果表明，不同产地和基原的药材水煎液中5-HMF含量有所差异，棉团铁线莲含量>威灵仙>东北铁线莲，其中棉团铁线莲含量最高达到0.2116 mg·g-1，东北铁线莲含量最低0.0148 mg·g-1，两者相差约15倍。

表5 不同产地威灵仙中的5-HMF含量测定结果(mg·g-1，n=6)

2.4 生成机制研究

2.4.1大孔树脂流分的分析

2.4.1.1 大孔树脂的分离

取超声提取下的水提液，加入预处理好的D101型大孔吸附树脂，静态吸附3 h后，依次用200 mL去离子水、200 mL95%乙醇溶液进行洗脱，分别收集洗脱液，减压浓缩，得水洗流分和95%乙醇流分，分别定容至200 mL。采用显色反应鉴定流分中的成分类别，显色反应类型及现象见表6。

表6 各流分的成分种类鉴别

结果显示，水洗流分对苯酚-硫酸反应、银镜反应、斐林反应呈阳性，对醋酐-浓硫酸反应和盐酸-镁粉反应为阴性，而95%乙醇流分则相反。表明，水洗流分中的主要成分包含还原性多糖，不含皂苷和黄酮；95%乙醇流分中含有皂苷类和黄酮类化合物，不含糖类成分。

2.4.1.2 流分加热回流

取“2.4.1.1”项下10 mL水洗流分、10 mL 95%醇洗流分分别放入25 mL圆底烧瓶中，平行3份，分别于60℃、80℃、100℃加热回流1 h，将样品溶液经0.45 μm滤膜过滤，分别定容至10 mL，进行色谱条件分析。结果表明，水洗流分经100℃回流后产生5-HMF，且含量与表4结果基本一致，并且提取温度是影响5-HMF含量的关键因素，与2.3实验结果一致。醇洗流分不产生5-HMF，这说明威灵仙中的5-HMF主要由糖类物质降解产生。(见图2、表7)。

水洗流分：A.100℃；B.80℃；C.60℃；醇洗流分：D.100℃；E. 80℃；F. 60℃；1∶5-HMF。

流分流分中的5-HMF含量/(μg·mL-1)换算为生药材中的5-HMF含量/(mg·g-1)100℃80℃60℃100℃80℃60℃水洗16.561.050.260.160.010.0026醇洗0.64——0.0064——

2.4.2水提醇沉部位分析

取超声提取的超声冻干物平行2份，分别加入70%乙醇和无水乙醇，超声溶解后分离上清液和沉淀。采用显色反应鉴定水提醇沉各部位的成分类别，结果见表8。分别取适量70%醇沉和100%醇沉部分的上清液和沉淀，加入适量纯化水，在100℃下的加热回流6 h，将样品溶液经0.45 μm滤膜过滤后，按色谱条件分析，结果见图3。

A：70% ETOH上清液；B：70% ETOH沉淀；C：100% ETOH上清液：D：100% ETOH沉淀；5-HMF。

表8结果显示，70%醇沉上清液对银镜反应、斐林反应呈阳性，对苯酚-硫酸反应呈阴性，而70%醇沉沉淀则相反；70%醇沉上清液主要是还原性寡糖，而沉淀中的多糖类成分为非还原性多糖。100%醇沉上清液均呈阴性反应，100%醇沉沉淀则相反，表明100%醇沉上清液不含糖，其沉淀为多糖类成分。

表8 醇沉各部位的成分种类鉴别

由图3可知， 70%醇沉上清液加热后产生大量5-HMF，沉淀未产生5-HMF，而100%醇沉结果相反，说明5-HMF主要由还原性寡糖产生。

3 结论

本研究比较了水回流提取和超声提取，结果表明，超声提取未产生5-HMF，水回流提取产生5-HMF，且温度是其产生的关键因素。在此基础上，通过正交试验确定回流提取的最佳提取工艺参数。

本研究建立了威灵仙中5-HMF的HPLC含量测定方法，方法简便、可靠、准确。将之应用于考察回流提取工艺条件对5-HMF含量的影响，并探究5-HMF的来源。研究结果发现，5-HMF主要是由威灵仙中的还原性寡糖降解产生，提取温度是影响威灵仙提取物中5-HMF含量的关键因素。在100℃提取温度下，不同产地威灵仙的煎煮液中均检测含有5-HMF，含量范围为0.0148～0.2116 mg·g-1，含量最高相差15倍。由于威灵仙临床多为煎煮后入药，因此煎煮液中必然含有一定量的5-HMF为患者所服用。为有效避免煎煮过程中产生5-HMF，保障用药安全，建议降低威灵仙的煎煮温度至60℃左右。