年糕杀菌工艺及其对年糕中微生物影响的研究

孙同辉，陈 洁*，许 飞，陈 玲

1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001 2.华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州 510640

年糕是一种历史悠久的半方便性米制品，具有浓郁的地方特色[1]。年糕水分含量较高，且制作与贮藏过程中原辅料、半成品及成品都直接与水或空气接触[2]，很容易受到细菌、真菌污染发生变质而失去食用价值，甚至引发食物中毒[3]，所以年糕普遍存在货架期短等问题，从而影响这一传统食品的工业化持续发展[4]。

传统的年糕保鲜技术主要有高温高压灭菌和巴氏杀菌技术。经高温高压灭菌的年糕虽然有较长的保质期，但容易发硬和变黄，难以保持原有口感；经巴氏杀菌的年糕，由于杀菌不彻底容易导致发霉变质[5]。李共国等[6]研究了杀菌条件对年糕色泽、硬度和咀嚼度等的影响，杀菌温度过高会产生褐变和硬度增大等现象；蔡怀依等[7]等研究了乙醇喷涂对年糕保鲜效果的影响，结果表明，乙醇喷涂可以控制年糕硬度增大和褐变，有效防止水分流失，虽然有较好的抑菌杀菌效果，但可能会影响年糕原有的米香味。

作者通过正交试验对酸洗结合水浴处理的杀菌方式进行优化，得到最优杀菌工艺。同时采用传统分离鉴定方法对年糕中微生物菌群进行分析，探究杀菌工艺对微生物菌群的影响，为年糕保鲜技术的进一步开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

糯米：中粮米业(五常)有限公司；粳米：中粮米业(巢湖)有限公司；高温蒸煮袋：沧州华良包装装潢有限公司。

1.1.2 试剂

平板计数琼脂、孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：北京奥博星生物技术有限责任公司；营养琼脂培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；乳酸、琼脂粉：天津市科密欧化学试剂有限公司；氯化钠、无水乙醇：天津市天力化学试剂有限公司；DNA提取试剂酚：北京索莱宝科技有限公司；2×Power Tap PCR Master Mix：天根生化科技(北京)有限公司；引物P0、P6、ITS1、ITS4：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 仪器与设备

MFD15多功能一步成型机：广东衡联食品机械有限公司；400型真空(充气)包装机：郑州星火包装机械有限公司；双哈牌YX280型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器：上海三中医疗器械有限公司；SW-CJ-1D型单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；恒温振荡器：常州国华电器有限公司；生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；TC-300 PCR仪：英国Techne公司；QL-866型旋涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；5418 R 离心机：德国Eppendorf公司。

1.3 试验方法

1.3.1 年糕加工工艺流程

原料米(粳米、糯米)→淘洗→浸泡7 h→挤压熟化→胶凝化→酸洗→沥干→真空包装→水浴灭菌。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 酸洗液体积分数对年糕品质的影响

将凝胶化后的年糕用0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%的乳酸洗液冲洗5 min，沥干表面水分，用高温蒸煮袋真空包装，95 ℃水浴30 min，37 ℃放置10 d，测定初始菌落总数并进行感官评价，每组试验平行进行3次。

1.3.2.2 酸洗时间对年糕品质的影响

将凝胶化后的年糕用1.0%的酸洗液分别冲洗1、5、10、20、30 min，沥干表面水分，用高温蒸煮袋真空包装，95 ℃水浴30 min，37 ℃放置10 d，测定初始菌落总数并进行感官评价，每组试验平行进行3次。

1.3.2.3 水浴温度对年糕品质的影响

将凝胶化后的年糕用1.0%的酸洗液冲洗5 min，沥干表面水分，用高温蒸煮袋真空包装，85、90、95、100 ℃水浴处理30 min，37 ℃放置10 d，测定初始菌落总数并进行感官评价，每组试验平行进行3次。

1.3.2.4 水浴时间对年糕品质的影响

将凝胶化后的年糕用1.0%的酸洗液冲洗5 min，沥干表面水分，用高温蒸煮袋真空包装，95 ℃水浴处理20、30、40、50 min，37 ℃放置10 d，测定初始菌落总数并进行感官评价，每组试验平行进行3次。

1.3.3 正交试验

在单因素试验基础上，以初始菌落总数和感官评分为评价指标，选取酸洗液体积分数、酸洗时间、水浴温度和水浴时间为考察因素，设计四因素三水平正交试验，因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.3.4 微生物总数测定

参照GB 4789.2—2016和GB 4789.15—2016测定微生物总数。

1.3.5 感官评价方法

由专业感官评定小组对年糕的色泽、弹性、口感、硬度和风味等指标进行综合评价，年糕感官评价标准见表2。

1.3.6 杀菌工艺对年糕微生物菌群的影响

1.3.6.1 年糕中微生物菌群提取

分别取3袋鲜样期和杀菌后的年糕样品，在无菌条件下各取25 g加入225 mL生理盐水中，剪碎后用均质器均质2 min，取不同稀释梯度的菌悬液，分别在平板计数琼脂和孟加拉红培养基培养计数，观察、编号并记录菌落形态，计算各菌种所占比例[8-9]。选取符合计数条件的平板，挑取不同菌落形态且占比较大的菌落进行反复划线分离至菌落较纯。在进行划线提纯时，细菌在营养琼脂培养基上36 ℃培养48 h；真菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上28 ℃培养5 d。

表2 年糕感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria for rice cake

1.3.6.2 年糕中微生物菌群DNA提取

细菌和真菌DNA模板提取参考文献[10]的传统分离培养方法。

1.3.6.3 基因扩增

以提取的DNA稀释液为PCR扩增反应的模板，以无菌双蒸水为模板作阴性对照，利用25 μL反应体系(正向引物、反向引物各1 μL，酶(2×Power Tap PCR Master Mix)12.5 μL，双蒸水9.5 μL，模板DNA 1 μL)进行PCR扩增。真菌扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30个循环，72 ℃保持10 min，所用引物为ITS1和ITS4；细菌扩增程序：PCR循环中变性时间为1 min，退火时间为1 min，延伸时间为1.5 min，所用引物为P0和P6[9](P0∶5′-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′；P6∶5′-CTA CGG CTA CCT TGT TAC-3′)。

1.3.6.4 基因测序及序列分析

将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将结果与NCBI GenBank数据库的Blast程序中已知的序列进行比对，获取同源性较高的菌株的序列信息，并鉴定微生物种类。

1.4 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 24 和 Origin 2017 进行数据处理与统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酸洗液体积分数对年糕品质的影响

如图1所示，随酸洗液体积分数的增加，年糕初始菌落总数呈逐渐递减的趋势，主要是因为随着酸洗液体积分数的增加，酸洗液中H+浓度增加，酸洗相同时间时，年糕表面H+浓度逐渐升高，pH值越低，抑菌效果越好[11]。随酸洗液体积分数的增加，年糕感官评分呈先上升后下降的趋势，乳酸为食品酸味剂，在一定程度上可以改善食品风味[12]，但酸洗液体积分数过大会导致年糕有明显乳酸味道[13]，严重影响其风味和口感。酸洗液体积分数为1.0%和2.0%时，感官评分较高，但酸洗液体积分数为1.0%时的抑菌效果较差，因此选定酸洗液体积分数为2.0%。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，图2、图3、图4同。图1 酸洗液体积分数对年糕初始菌落总数与感官评分的影响Fig.1 Effect of the volume fraction of pickling solution on the total number of initial colonies and sensory score of rice cake

2.1.2 酸洗时间对年糕品质的影响

图2 酸洗时间对年糕初始菌落总数与感官评分的影响Fig.2 Effect of pickling time on the total number of initial colonies and sensory score of rice cake

如图2所示，随着酸洗时间延长，年糕初始菌落总数呈逐渐降低的趋势，酸洗时间越长，可以使乳酸充分作用于年糕，增加年糕表面H+浓度，从而达到较好的抑菌效果。随着酸洗时间延长，年糕感官评分呈先上升后下降的趋势，大米淀粉在酸性条件下水解糊化形成的凝胶网络结构可吸附水分子，具有一定的保水效果[14]，在合适的时间内，会使年糕的口感风味变好，但如果酸洗时间过长，会破坏年糕表面的凝胶膜状态，令其粘连、烂糊[11]，导致年糕感官评分降低。综合考虑，选定酸洗时间为20 min。

2.1.3 水浴温度对年糕品质的影响

热杀菌是食品加工与保存中用于改善食品品质、延长贮藏期最重要的处理方法之一[15]。如图3所示，随着水浴温度升高，年糕体系中初始菌落总数呈逐渐下降趋势，水浴时间相同时，水浴温度越高，杀菌抑菌效果越好。随着水浴温度升高，年糕感官评分呈先升高后逐渐下降趋势，水浴温度越高，年糕褐变越严重[4]，硬度会随着水浴温度升高而增加，导致年糕口感变差，食用品质降低。沈庆霞等[16]发现年糕直链淀粉含量随着灭菌温度的增加而有所升高，在淀粉高温糊化后的冷却凝胶过程中，淀粉分子通过氢键交联聚合，直链淀粉含量越高，生成的氢键越多，使凝胶硬度增大，进而表现为年糕硬度增加，严重影响食用品质，导致年糕感官评分降低。

图3 水浴温度对年糕初始菌落总数与感官评分的影响Fig.3 Effect of water-bath temperature on the total number of initial colonies and sensory scoreof rice cake

2.1.4 水浴时间对年糕品质的影响

如图4所示，随着水浴时间的延长，初始菌落总数呈下降趋势，相同水浴温度时，水浴时间越长，年糕内部热传递效果越好，从而抑制微生物的生长繁殖，达到较好的抑菌杀菌效果。随着水浴时间的延长，年糕感官评分先升高后逐渐降低。水浴时间越长，年糕色泽变黄、质地变硬现象越明显，同时会使年糕发生粘连和严重变形，还显著影响其复水性能[17]，导致年糕在贮藏期内食用品质下降。

图4 水浴时间对年糕初始菌落总数与感官评分的影响Fig.4 Effect of water-bath time on the total number of initial colonies and sensory score of rice cake

2.2 正交试验

正交试验结果见表3，方差分析见表4。

由表3可知，各因素对初始菌落总数影响的主次顺序为D>C>B>A，最优组合为A3B3C2D2，即酸洗液体积分数3.0%、酸洗时间15 min、水浴温度95 ℃、水浴时间40 min；各因素对感官评分影响的主次顺序为A>C>B>D，最优组合为A1B3C2D1，即为酸洗液体积分数2.0%、酸洗时间15 min、水浴温度95 ℃、水浴时间30 min。由表4可知，酸洗液体积分数、水浴温度和水浴时间对初始菌落总数均有极显著影响，酸洗时间有显著影响；酸洗液体积分数对感官评分有极显著影响，水浴时间对感官评分影响不显著。综合考虑，选定最优方案为A1B3C2D2，即酸洗液体积分数2.0%、酸洗时间15 min、水浴温度95 ℃、水浴时间40 min。采用优化后的杀菌工艺进行3次验证试验，年糕常温货架期可达6个月，且品质保持较好。

表3 正交试验设计及结果Table 3 Results of orthogonal design

2.3 杀菌工艺对年糕中微生物菌群的影响

将鲜样期和杀菌后的年糕分组编号为①和②，将测序结果与NCBI数据库进行同源性比对，年糕中细菌和真菌序列分析见表5、表6。通过累积柱状图对年糕中的微生物菌群相对丰度做进一步说明，结果见图5、图6。

由表5和图5可知，在属水平上，鲜样期年糕中芽孢杆菌属(Bacillus)所占比例最大，约为88.24%，其次为微球菌属(Micrococcus)，所占比例为6.75%，产酸克雷伯杆菌(Klebsiellaoxytoca)占5.00%，其他菌属占0.01%；杀菌后年糕中细菌腐败菌种类迅速减少，以芽孢杆菌属(Bacillus)为主，其他腐败菌已被杀死或浓度低于检出限，未被检测到。综上所述，此杀菌工艺可以有效抑制年糕中细菌的生长繁殖，达到较好的杀菌抑菌效果。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

注：*表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01。

由表6和图6可知，在属水平上，鲜样期年糕中的真菌菌属分别是青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、篮状菌属(Talaromyces)，所占比例分别为63.63%、22.32%和14.03%。杀菌后年糕中青霉属所占比例较大，约为82.34%，篮状菌属占17.66%，青霉属广泛分布于土壤、空气、植物和室内等环境中，能够分泌具有高活性的蛋白质、多糖和脂肪等大分子物质的水解酶类[18-20]。此外青霉属的适应能力很强，对营养物质、pH值和温度变化的敏感性较弱，在食品加工过程中，其有性型篮状菌亚属的有性孢子比无性孢子的耐热性和抗性均较强，不易被杀死[21]。

表5 年糕中细菌序列分析Table 5 Bacterial sequence analysis of rice cake

表6 年糕中真菌序列分析Table 6 Sequence analysis of fungi in rice cake

图5 年糕中细菌菌种的相对丰度Fig.5 Relative abundances of bacterial strains in rice cake

图6 年糕中真菌菌种的相对丰度Fig.6 Relative abundances of fungal strains in rice cake

3 结论

采用酸洗结合水浴处理的杀菌方式，以初始菌落总数和感官评分为评价指标，设计正交试验对杀菌工艺进行优化。结果表明，最优杀菌工艺为酸洗液体积分数2.0%、酸洗时间15 min、水浴温度95 ℃、水浴时间40 min。通过传统分离鉴定方法对年糕中的微生物菌群进行分析，发现鲜样期年糕中细菌主要有芽孢杆菌属、微球菌属、产酸克雷伯杆菌及少量其他杂菌，真菌主要有青霉属、曲霉属和篮状菌属。杀菌后年糕中细菌主要是芽孢杆菌属，真菌主要是青霉属，杀菌后年糕货架期可达6个月，杀菌工艺可以有效抑制年糕中微生物的生长繁殖，同时为进一步开发年糕保鲜措施提供依据。