金银花不同溶剂提取物多酚含量及抗氧化活性
2020-03-23王桂林徐未芳刘乐范建凤赵三虎赵二劳
王桂林，徐未芳，刘乐，范建凤，赵三虎，赵二劳
（忻州师范学院，山西忻州034000）
金银花（Lonicera japonica）为忍冬科多年生植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花[1]，药食两用，为药用历史悠久的常用中药，我国各省均有分布，资源丰富[2-4]。金银花性寒，味甘，入肺、心、胃经，具有清热解毒、抗炎、补虚疗风之功效[5]，临床常用于胀满下疾、温病发热，热毒痈疡和肿瘤等症。现代药理研究表明，多酚是金银花中的主要有效成分，具有抗氧化、抗病毒、抗炎、解热、保肝、降血脂、兴奋中枢神经和调节免疫等功效[6-8]，在食品、调味品、保健和医药等领域有广阔的应用前景。但近年来有关金银花中多酚的研究，仅见游玉明等[9]金银花中多酚高效液相色谱-二极管阵列法测定、邹容等[10]干燥方式对金银花多酚及其抗氧化活性影响、以及陈垒等[11]金银花多酚诱导癌H1299 细胞凋亡的研究，鲜见金银花多酚提取及其抗氧化活性的研究。基于此，本研究采用不同溶剂提取金银花多酚，并利用清除 DPPH·、·OH 和 ABTS+·法评价其抗氧化活性，以期为金银花资源的深度开发及其多酚研究应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
金银花：忻州市本草堂大药房（产地河南封丘），烘箱中45 ℃干燥后，粉碎过40 目筛，装瓶保存，待用。
DPPH：日本东京化成工业株式会社；ABTS：sigma公司；福林-酚试剂（生化试剂）：上海源聚生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.1.2 主要仪器
723 型分光光度计、pHS-3B 型精密pH 计：上海光谱仪器有限公司；AL104 电子分析天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ-400KDE 型高功率数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；THZ-82 水浴恒温振荡器：江苏省金坛市荣华仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 金银花提取液制备
精确称取金银花粉各3.0 g，参考文献[12-13]的方法，按料液比 1 ∶20（g/mL）分别加入不同溶剂（水、70%甲醇、70%乙醇和70%丙酮），充分润湿后，在温度50 ℃、超声功率200 W 的条件下，提取20 min，抽滤，滤液浓缩，真空干燥得不同溶剂提取浸膏，浸膏分别用无水乙醇溶解后定容为100 mL，冰箱保存待测。
1.2.2 多酚提取量的测定
1.2.2.1 没食子酸标准曲线绘制
以没食子酸为标准品，参考文献[14-15]采用Folin-Ciocalten 法进行。测得在0.0～7.0 mg/mL 浓度范围内没食子酸与其吸光度线性关系良好，标准曲线回归方程为：A=0.071 4c+0.007 2，R2=0.999 2。
式中：A 为吸光度值；c 为没食子酸质量浓度，mg/mL。
1.2.2.2 不同溶剂金银花中多酚提取量的测定
适当稀释后移取不同溶剂金银花多酚提取液各1.0 mL，置于25 mL 比色管中，按1.2.2.1 的方法测定，由标准曲线方程计算多酚提取量。多酚提取量计算按下式进行。
多酚提取量/（mg/g）=提取液中多酚量（mg）/金银花用量（g）
1.2.3 不同溶剂金银花多酚的抗氧化活性
以氧化剂2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）为阳性对照，采用清除 DPPH·、·OH 和ABTS+·法评价不同溶剂金银花多酚的抗氧化性。对自由基的清除率越大，其抗氧化活性越强。
1.2.3.1 不同溶剂金银花多酚对DPPH·的清除率
试验参照文献[16-17]方法，测定不同溶剂金银花多酚和BHT 对DPPH·的清除率。由下式计算清除率。
式中：A0为DPPH·溶液体系的吸光度；Ai为加入金银花多酚溶液（或BHT 溶液）后DPPH·溶液体系吸光度；Aj为金银花多酚溶液（或BHT 溶液）本底吸光度。
1.2.3.2 不同溶剂金银花多酚对·OH 的清除率
试验参照文献[18-19]采用水杨酸法测定不同溶剂金银花多酚和BHT 对·OH 的清除率。由下式计算清除率。
式中：A0为未加金银花多酚溶液（或BHT 溶液）·OH 体系的吸光度；A1为加入金银花多酚溶液（或BHT 溶液）·OH 体系的吸光度；A2为金银花多酚溶液（或BHT 溶液）本底吸光度。
1.2.3.3 不同溶剂金银花多酚对ABTS+·的清除率
参照文献[20-21]方法，配置反应溶液并测定不同溶剂金银花多酚和BHT 对ABTS+·的清除率。由下式计算清除率。
式中：A0为未加金银花多酚溶液（或BHT 溶液）ABTS+·体系的吸光度；A1为加入金银花多酚溶液（或BHT 溶液）ABTS+·体系的吸光度；A2为金银花多酚溶液（或BHT 溶液）本底吸光度。
1.3 数据处理
试验均重复 3 次，Excel2007 作图，SPSS 分析数据（p＜0.01 差异极显著；p＜0.05 差异显著；p＞0.05 差异不显著）。
2 结果与分析
2.1 不同溶剂金银花多酚提取量
按试验方法，测得金银花多酚不同溶剂提取量如表1。
表1 金银花多酚提取量Table 1 Extraction amount of polyphenols from honeysuckle
由表1 可知，在其它提取条件相同时，金银花多酚不同溶剂提取量不同，70%丙酮提取量＞70%乙醇提取量＞70%甲醇提取量＞水，即溶剂极性小，多酚提取量多。以水为溶剂与以有机溶液为溶剂，金银花多酚提取量有极显著差异（p＜0.01），有机溶剂70 %甲醇和70 %乙醇与70 %丙酮的多酚提取量也有显著差异（p＜0.05），70%甲醇与70%乙醇的多酚提取量基本相当（p＞0.05）。表明金银花中脂溶性多酚的含量远大于水溶性多酚。提示在进行金银花多酚提取研究时，应选择有机溶液为溶剂，同时考虑金银花多酚的食用或药用安全性，应选择乙醇溶液为溶剂。有关金银花中多酚的种类，还有待进一步深入研究。
2.2 不同溶剂金银花多酚对DPPH·的清除率
按试验方法测定不同溶剂金银花多酚和BHT 对DPPH·清除率，结果如图1。
图1 不同溶剂金银花多酚和BHT 对DPPH·的清除率Fig.1 Scavenging rate different solvent polyphenols from honeysuckle and BHT on DPPH·
由图1 可知，不同溶剂金银花多酚和BHT 对DPPH·的清除率均随其浓度升高而增大，与浓度具有一定的相关性。不同溶剂金银花多酚对DPPH·的清除率均小于BHT，且差异显著（p＜0.05），但也表明不同溶剂金银花多酚对DPPH·均具有一定的清除能力，即抗氧化活性。同时也可知，对DPPH·清除能力的强弱为甲醇提多酚＞水提多酚＞丙酮提多酚＞乙醇提多酚。表明不同溶剂提取的金银花多酚，对DPPH·的清除能力不同，其原因可能是由于不同溶剂提取的金银花多酚种类不同，其活性不同，清除DPPH·能力不同，这与文献[9]研究表明金银花中含有多种多酚类成分的结果一致。
2.3 不同溶剂金银花多酚对·OH的清除率
按试验方法测定不同溶剂金银花多酚和BHT 对·OH 的清除率，结果如图2。
图2 不同溶剂金银花多酚和BHT 对·OH 的清除率Fig.2 Scavenging rate different solvent polyphenols from honeysuckle and BHT on·OH
由图2 可知，不同溶剂金银花多酚对·OH 均具有一定的清除能力，随其浓度的增加清除率增大，具有一定的浓度相关性，且不同溶剂金银花多酚对·OH 的清除率均大于BHT。同时也可知，对·OH 清除能力的强弱基本为丙酮提多酚＞乙醇提多酚＞甲醇提多酚＞水提多酚。表明不同溶剂金银花多酚，对·OH 的清除能力不同，同样反映不同溶剂提取的金银花多酚种类可能不同，导致对·OH 的清除率不同。
2.4 不同溶剂金银花多酚对ABTS+·的清除率
按试验方法测定不同溶剂金银花多酚和BHT 对ABTS+·的清除率，结果如图3。
图3 不同溶剂金银花多酚和BHT 对ABTS＋·的清除率Fig.3 Scavenging rate different solvent polyphenols from honeysuckle and BHT on ABTS＋·
由图3 可知，不同溶剂金银花多酚对ABTS+·均具有一定的清除能力，其和BHT 对ABTS+·的清除率随浓度的增加而增大，且不同溶剂金银花多酚对ABTS+·的清除率均小于BHT。此外，对ABTS+·清除能力的强弱基本为水提多酚＞甲醇提多酚＞丙酮提多酚＞乙醇提多酚。表明不同溶剂提取的金银花多酚，对ABTS+·的清除能力不同，也反映不同溶剂提取的金银花多酚种类可能不同，导致对ABTS+·的清除率不同。
综上不同溶剂金银花多酚和BHT 溶液对DPPH·、·OH 和ABTS+·的体外清除试验研究表明，不同溶剂提取的金银花多酚均具有一定的清除DPPH·、·OH 和ABTS+·能力，即具有一定的抗氧化活性，但它们清除DPPH·、·OH 和 ABTS+·的能力不同，存在明显差异（p＜0.05）。表明金银花中含有不同种类的多酚，不同溶剂提取的金银花多酚种类不同。同时由不同溶剂提取的金银花多酚对DPPH·和ABTS+·的清除率小于BHT，而对·OH 的清除率大于BHT，也提示我们，通过清除自由基法评价物质抗氧化活性，不能仅采用一种清除自由基体系，而应同时采用多种清除自由基体系综合分析，才能得到科学、准确的结论。
3 结论
分别以水、70%甲醇、70%乙醇和70%丙酮为提取剂，超声辅助提取金银花中多酚，采用Folin-Ciocalteu 法测定提取物中多酚量，并利用清除DPPH·、·OH和ABTS+·法评价其抗氧化活性。结果表明，金银花不同溶剂水、70%甲醇、70%乙醇和70%丙酮提取物中多酚含量分别为 18.97、46.56、46.63、48.49 mg/g，以水为溶剂与以有机溶液为溶剂，金银花多酚提取量有极显著差异（p＜0.01）。不同溶剂金银花多酚均具有一定的清除DPPH·、·OH 和ABTS+·能力，即抗氧化活性，但不同溶剂金银花多酚对自由基的清除能力不同，推测不同溶剂提取的金银花多酚种类有所不同。研究结果为金银花多酚的深入研究及作为天然抗氧化剂用于食品、保健和医药等领域提供了依据。
