金花茶花多酚氧化酶提取工艺研究

刘畅，吴雪辉，陈嘉慧

（华南农业大学食品学院，广东广州510642）

金花茶（Camellia nitidissima Chi）为山茶科，山茶属，金花茶组植物，是中国的珍贵茶种，拥有“茶族皇后”、“植物界大熊猫”等美誉[1-2]。金花茶的主产地在我国广西，目前云南、广东、贵州等地区也有分布。许多研究表明，金花茶的花、茎、叶都有充分利用的价值，金花茶是唯一带有金黄色花瓣的茶花品种，花瓣呈蜡质，富含可溶性糖、多酚、黄酮等多种生物活性成分以及微量元素，拥有降血糖、降血压、抗肿瘤和提高机体免疫力等多种功效作用，具有极高的观赏价值、经济价值和极大的市场开发潜力，受到了广泛地关注[1-8]。

国内外对金花茶的研究主要集中于金花茶的遗传多样性、功能活性成分的分离纯化、结构分析以及新产品的开发利用。目前已上市的金花茶产品主要分为3 类包括茶饮料、保健品以及化妆品，其中茶饮料以金花茶叶为主，而金花茶花的产品较为稀少[9-14]。金花茶花的产品主要是花朵茶和花蕾茶，需要进行一定的加工、干燥而成，在加工过程中如何保持花的颜色和形态尤为关键[4]。

研究表明，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是造成果蔬和植物褐变的主要酶类，PPO 活性与褐变程度一般呈显著相关性[15-18]。前期试验结果表明，以PPO 为主的酶促褐变是金花茶花加工过程中颜色变化的主要原因。为深入探究金花茶花PPO 活性与褐变的相关性、寻求抑制褐变的方法，对金花茶花PPO 提取工艺条件进行优化研究，这也为金花茶花PPO 的性质进一步研究以及金花茶花的开发利用提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金花茶鲜花：广东省佛山市林业科学研究所金花茶示范林，品种为普通金花茶。

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、磷酸氢二钠、柠檬酸、邻苯二酚（均为分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

722 可见分光光度计、PHS-3C 型精密 PH 计：上海佑科仪器仪表有限公司；TGL-16M 高速冷冻离心机：湖南湘仪试验室仪器开发有限公司；HZK-FA110电子天平：福州华志科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 金花茶花PPO 粗酶液的提取

参照周燕燕方法[19]，稍作修改。挑选金花茶鲜花1 g 左右，加入pH 6.4 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液6 mL，（内含 15%PVP），研磨 10 min，在 4 ℃浸提 30 min，9 000 r/min 冷冻离心15 min，收集上清液即为粗酶液。

1.3.2 单因素试验

采用1.3.1 的方法提取金花茶花PPO，考察不同pH 值、浸提时间、PVP 添加量对金花茶花PPO 提取量的影响。

1.3.3 Box-Behnken 中心组合试验设计

在单因素试验结果的基础上，采用Box-Behnken响应面法试验设计模型，以缓冲液pH 值、浸提时间以及PVP 添加量为自变量，以PPO 提取量为响应值，进行响应面分析，因素水平如表1 所示。

表1 试验因素与水平设计Table 1 Experimental factors and horizontal design

1.3.4 建立神经网络模型

本试验运用BP 神经网络进行建模，模型包含3层拓扑结构，输入层、隐含层以及输出层，其中将自变量3 个因素作为网络的输入，因变量作为网络的输出，构建一个3-6-1 结构的级联BP 神经网络。模型建立后，采用Matlab（2016b）软件进行编程，选择双曲正切传递函数（tansig）作为隐含层传递函数，线性传递函数（purelin）作为输出层传递函数，设置隐含层1 个，内含神经元6 个，通过Levenberg-Marquardt 算法对新建BP 网络进行训练，设定网络训练参数值，最大训练次数为1 000 次，并采用均方误差（mean-square error，MSE）评估神经网络模型的预测性能，以所有的试验数据作为神经网络的训练样本进行模拟与仿真。与此同时比较分析响应面模型与人工神经网络的优化结果。

1.4 金花茶花PPO提取量的测定

金花茶花PPO 提取量的测定参照李鹏[20]的方法。取pH 6 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液5 mL，加入0.5 mol/L 邻苯二酚溶液1 mL，在室温（20 ℃）条件下，将0.5 mL 粗酶液与上述溶液混合均匀后立即倒入5 cm 比色皿中，420 nm 处测定其吸光度，从酶液加入后开始计时，每30 s 记录一次吸光度，共4 min。以底物溶液为空白组，计算酶的提取量，以酶活力代表酶的量。一个酶活力单位（U）定义为：在测定条件下，单位时间内引起吸光度改变0.001 所需的酶量，计算公式如下：

式中：ΔA420nm为反应时间内OD 变化值；VT为提取粗酶液总体积，mL；M 为金花茶花鲜重，g；t 为反应时间，min；VS为测定时取用酶液体积，mL。

1.5 数据处理

利用 Design-Expert 8.0.6 软件和 Matlab（2016b）软件进行数据处理、回归分析及神经网络的建立、训练。

2 结果与分析

2.1 缓冲液pH值对金花茶花PPO提取量的影响

称取1 g 左右金花茶鲜花，分别加入pH 5.8、6.0、6.4、6.8、7.0 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液 6 mL，（内含 15 % PVP），研磨 10 min，在 4 ℃浸提30 min，9 000 r/min 冷冻离心15 min，收集上清液测定吸光值并计算金花茶花PPO 提取量。结果如图1 所示。

由图1 可知，金花茶花PPO 提取量随缓冲液pH 值的增加呈先升高后降低的趋势，缓冲液pH 值在6.0～6.4范围内，PPO 提取效果好，最大值为1 178.90 U/（g·min），当缓冲液pH 6.4 时，PPO 提取量开始明显下降，所以选择pH 6.4 作为缓冲液pH 值的最优条件。

2.2 浸提时间对金花茶花PPO提取量的影响

图1 缓冲液pH 值对金花茶花PPO 提取量的影响Fig.1 Effect of buffer pH on the extraction amount of PPO from Camellia nitidissima flowers

称取1 g 左右金花茶鲜花，分别加入pH 6.8 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液6 mL，（内含15%PVP），研磨 10 min，在 4 ℃分别浸提 0、15、30、45、60 min，9 000 r/min 冷冻离心15 min，收集上清液，测定吸光值并计算金花茶花PPO 提取量。结果如图2 所示。

图2 浸提时间对金花茶花PPO 提取量的影响Fig.2 Effect of extraction time on the extraction amount of PPO from Camellia nitidissima flowers

由图2 可知，PPO 提取量随着浸提时间的延长先缓慢下降又明显升高，当浸提时间为45 min 时，PPO提取量达到最大值为1 333.11 U/（g·min），此后，继续延长浸提时间，PPO 提取量开始下降。这是因为在一定范围内随着时间的不断延长，利于酶蛋白的溶出，当溶出量达到最高至平衡时，继续延长时间，由于酶蛋白在液态中构象极其不稳定水解，导致酶的提取量下降。

2.3 PVP添加量对金花茶花PPO提取量的影响

PVP 是一种酚类吸附剂，它与酚类物质形成复合物，从而抑制酚类化合物与PPO 的聚合。称取1 g 左右金花茶鲜花，分别加入pH 6.8 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液6 mL，分别添加10%、15%、20%、25%、30%PVP，研磨 10 min，在 4 ℃浸提 30 min，9 000 r/min 冷冻离心15 min，收集上清液，测定吸光值并计算金花茶花PPO 提取量。结果如图3 所示。

图3 PVP 添加量对金花茶花PPO 提取量的影响Fig.3 Effect of PVP on the extraction amount of PPO from Camellia nitidissima flowers

如图3 所示，PPO 提取量随着PVP 量的增加先上升后下降，当PVP 添加量达到20%时，PPO 提取量达到峰值1 115.31 U/（g·min）。因为适当地添加PVP，能够有效地抑制酚类物质与PPO 的聚合，利于PPO 的溶出，而PVP 添加量过高将导致溶液体系过于黏稠，对PPO 的提取会造成不利影响。

2.4 金花茶花PPO提取工艺的响应面优化

2.4.1 BBD 试验设计方案与结果

在单因素基础上进行响应面优化试验，结果如表2 所示。

表2 Box-Behnken 试验设计方案与结果Table 2 Box-Behnken experiment design and results

2.4.2 回归方程拟合及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6 统计分析软件对表2 试验结果进行多元回归拟合，回归分析结果见表3。

金花茶花PPO 提取量对浸提时间（A）、缓冲液pH值（B）和PVP 添加量（C）的二次多项式回归模型为：

表3 回归模型的方差分析及回归系数的显著性检验Table 3 Analysis of variance for the established regression model

Y=1 793.11-16.54A-159.42B-130.97C+5.29AB-41.77AC-12.4BC-212.79A2-276.28B2-250.37C2。回归模型的决定系数R2=0.992 2，说明该模型与实际拟合良好，试验方法可靠，失拟项不显著（P＞0.05），因此可用此模型来优化金花茶花PPO 提取工艺。

2.4.3 模型双因素交互作用效应分析

根据Desig-Expert 得出各因素间的交互作用对金花茶花PPO 活力的影响，三维图和等高线图如图4所示。

图4 缓冲液pH 值、浸提时间与PVP 添加量交互作用的响应面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plot of buffer pH，extraction time and PVP addition

由图4b 可知，曲面较陡峭，说明浸提时间和PVP添加量之间的交互作用显著，原因是PVP 的性质随着浸提时间的变化而变化，导致PVP 对粗酶液中一些酚类物质的吸附作用发生改变，进而影响PPO 的提取量。

通过对回归方程求解，得最优提取工艺为浸提时间 45 min、缓冲液 pH 6.29、PVP 添加量为 19 %，此条件下模型的预测值为1 847.26 U/（g·min）。考虑实际操作，将试验条件定为浸提时间45 min、缓冲液pH 6.30、PVP 添加量为19%。

2.5 神经网络的训练与仿真

将所有的试验数据作为网络的训练样本进行训练和仿真。在级联BP 神经网络训练的过程中会将用来训练的训练样本按照默认比例随机划分为3 组样本：训练样本（train set）、验证样本（validation set）和预测样本（test set）。在Matlab 软件下进行编程并实现神经网络训练过程，结果见图5～图6。

图5 BP 人工神经网络的训练过程Fig.5 Training process of BP artificial neural network

图6 回归坐标图Fig.6 Regression coordinates

由图5 可知，在迭代次数为8 时，最佳验证性能0.003 807。经过8 次训练后网络的验证误差小于0.01，已达到平衡状态（图中圆点处），之后训练误差以及验证误差一直保持稳定，验证误差经过连续6 次迭代训练后不再减少，继续训练会造成过度拟合。因此该神经网络在训练了14 次迭代后性能已达到训练要求，说明该神经网络具有好的收敛性。

由图6 可知，3 类样本数据回归直线的相关系数分别为 0.957 07，0.991 7，0.970 71，所有训练样本回归直线的R=0.967 6，说明经过训练后的级联BP 神经网络的预测值与实测值具有良好的相关性。训练成熟的模型运行后得到最终优化的结果：浸提时间为45.06 min，缓冲液 pH 6.35，PVP 添加量为 22%，此条件下的模型预测值为1 825.7 U/（g·min），考虑试验操作得可行性，试验条件定为浸提时间为45 min，缓冲液pH 6.35，PVP 添加量为 22%。

2.6 优化结果的验证与比较

为了验证两种模型对金花茶花PPO 提取工艺优化的有效性，在最佳工艺条件下进行3 次重复试验并取平均值，结果如表4 所示。

表4 优化结果比较Table 4 Comparision of optimizing results

由表4 可知，通过神经网络模型优化的实际值高、相对误差小，但R2略小于响应面模型，说明响应面优化法可能出现了过度拟合的现象。因此神经网络模型的准确性更高，可信度更强。

3 结论

采用RSM 优化金花茶花PPO 提取工艺，优化的最佳条件为浸提时间45 min、缓冲液pH 6.29、PVP 添加量为19%，模型的预测值为1 847.26 U/（g·min）。验证模型结果的偏差率为2.49%，满足预期结果。ANN优化金花茶花PPO 提取工艺的最佳条件为浸提时间45 min、缓冲液 pH 6.35、PVP 添加量为 22%，模型的预测值为1 825.70 U/（g·min），验证模型结果的偏差为1.14%，ANN 模型的相对误差小于RSM，所以ANN 模型的精度更高，准确性更强。