外伤性癫痫生物标志物的研究进展

贾孝 ，周凤娟 ，代滨滨 ，王旭 ，杨天潼

（1.中国政法大学证据科学教育部重点实验室，北京 100088；2.司法文明协同创新中心，北京 100088）

外伤性癫痫（post traumatic epilepsy，PTE）以反复性外伤后癫痫发作（post traumatic seizures，PTS）为特征，是创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）的严重并发症[1]。根据癫痫发作的时间，PTS通常被分为3类：（1）即刻PTS，发生在伤后24 h内；（2）早期PTS，发生在伤后1周内；（3）晚期PTS，发生在伤后1周[2]。目前，已有研究[2]证实，大脑遭受物理性损伤所致的异常放电和刺激所致的阈值改变可能是即刻、早期PTS的原因。此后，随着出血、水肿、能量代谢障碍、离子环境破坏、胶质细胞超负荷和谷氨酸释放增加等病理生理变化，PTS持续发生[3]。原发性脑损伤和继发性脑损伤共同导致的病理生理过程持续一段时间后，脑损伤区脑组织分子结构和功能发生改变，继而出现胶质细胞不良增生、神经突触信号传导异常、兴奋性和抑制性突触传导失衡，并造成神经元网络结构重组，最终导致持续性、无端反复性PTS[1]。这种晚期的痫性发作即真正意义上的PTE。因此，在PTE发生和发展的过程中，也伴随有分子结构和功能的变化，并为PTE的鉴定提供了客观的生物标志物。

两院三部联合发布的《人体损伤致残程度分级》将PTE的残疾评定分为3个等级。从鉴定标准条款规定的具体内容来看，PTE的残疾程度应根据被鉴定人的癫痫发作类型、发作次数及药物疗效进行综合评定。然而在法医学鉴定实践中遇到PTE的客观评定仍然是一大挑战，原因如下：（1）虽然脑电图是诊断PTE的客观依据，但鉴定实践中，有很多被鉴定人限于条件没有及时进行脑电图检查，同时由于大部分癫痫发作地点在家中，到医院复诊时已无癫痫发作表现，获得发作期有意义的脑电图检查非常困难。因此，在鉴定实践中，有相当数量的鉴定缺乏客观的脑电图检查支持。（2）影像学检查也是诊断PTE的客观依据之一，但影像学检查结果尚不能与PTE完全对应。在鉴定实践中，PTE仅是颅脑损伤结局的一种，并不是颅脑损伤的唯一转归，虽然有软化灶等影像学表现，但并不意味着一定是PTE。因此，影像学诊断作为PTE客观诊断依据仍具有一定的局限性。如果能筛选出客观的生物标志物应用于PTE鉴定，或许能够得到更为客观、准确的鉴定意见。在癫痫研究领域，生物标志物有很多种类，但从法医学鉴定实践角度出发，血液和脑脊液易于获得，可供检测的项目也比较丰富。因此，本文就血液和脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中的生物标志物进行综述，为研究PTE发生发展过程中的病理学变化提供借鉴，同时为PTE的客观评定提供研究基础和思路。

1 神经炎症性生物标志物

神经炎症是PTE发生的主要病理生理学机制之一[4]。中、重度颅脑损伤后，损伤区的小胶质细胞和星形胶质细胞激活，外周免疫细胞迁移，体循环和脑组织分泌大量的炎症因子，导致神经元结构受损、突触重塑、神经元兴奋性增强进而诱发PTE[5]。

tau蛋白是一种微管结构相关蛋白，通过参与突触传递和维持微管稳定性保证神经元的正常功能[6]。目前，已有研究[6-7]表明，实验TBI大鼠和TBI后的伤者脑组织中均出现了tau蛋白过度磷酸化。而在中、重度TBI后的伤者外周血中，总tau蛋白水平明显高于正常人[8]。研究[6]表明，过度磷酸化的tau蛋白可引发神经元结构网络重组（如苔藓纤维发芽）、海马颗粒细胞层的神经元异常迁移、NR2B受体介导的谷氨酸释放等一系列异常，这些异常与PTE密切相关。LIU等[9]研究发现，抑制tau蛋白的过度磷酸化，PTE发作也同时被抑制，该研究结果不但证明了tau蛋白与PTE的相关性，同时也提示我们深入研究PTE中tau蛋白的含量变化，可为法医学PTE残疾评定提供客观的生物标志物。

炎症因子［包括白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）］与神经炎症密切相关。实验小鼠脑组织的IL-1β水平在TBI后可急剧升高，一般于伤后4d达到峰值[10]。IL-1β/IL-1R炎症信号通路可通过介导Ca2+、γ-氨基丁酸和谷氨酸代谢等途径导致神经元过度兴奋。同时，通过激活星形胶质细胞和小胶质细胞形成神经瘢痕，释放神经毒性介质，导致神经元丢失。该通路明显增强血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的通透性，募集更多的外周白细胞至脑组织中促使癫痫发作。DIAMOND等[11]已经证实人体CSF与血清中IL-1β比例越高，PTE发作的频率越高。

高迁移率族B1（high mobility group B1，HMGB1）蛋白是一种细胞内DNA结合蛋白，可通过激活胶质细胞、内皮细胞和外周免疫球蛋白引发免疫反应[12]。HMGB1与多种受体［如Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）2和TLR4］结合，导致丝裂原活化蛋白激酶磷酸化，进而活化核因子活化B细胞κ轻链增强子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）信号通路，调节炎症因子（包括IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α等）的表达，从而介导神经炎症诱发PTE。另外，有研究[13]结果表明，在获得性癫痫动物模型中，服用靶向氧化应激药物的大鼠可表现出HMGB1的阻断，从而降低癫痫发作频率。与HMGB1蛋白相似，热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）常与 TLR2、TLR4结合介导神经炎症[14]。da SILVA FIORIN等[15]研究表明，在神经元损伤2周后，癫痫组实验大鼠HSP70免疫表达增加，而HSP70可通过抑制早期炎症和氧化应激从而降低癫痫的发作频率。因此，他们预测HSP70具有神经保护功能从而可以有效治疗PTE，但该结果仍需进一步验证。综上所述，HMGB1、HSP70均具有作为候选生物标志物应用于法医学实践参与PTE残疾评定的潜在价值。

2 血管损伤性生物标志物

出血和血肿是PTE发生损伤的基础[16]。TBI后会出现各种不同程度的脑血管损伤，如脑微血管出血增加、血脑屏障通透性增加、硬脑膜下血肿和脑实质内出血等。DADAS等[17]指出，血脑屏障破坏是PTE的重要病理生理学机制，其中水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）发挥了关键作用。AQP4是星形胶质细胞中主要的水通道蛋白，对于维持中枢神经系统和细胞内离子平衡至关重要。据报道[18]，TBI后实验大鼠血清和CSF中AQP4均增加，水分子稳态破坏形成脑水肿，血脑屏障通透性升高。另外，DADAS等[17]还指出，在脑组织中，AQP4介导的水分子运动与钾离子（K+）传导相偶联。因此，AQP4可能通过介导K+通道，破坏血脑屏障进而诱发PTE。

转化生长因子β（transforming growth factors-β，TGF-β）是一种参与细胞分化、凋亡等多种生命进程的生长因子[19]。在获得性癫痫实验动物模型中，白蛋白与激活素受体样激酶5（activin receptor-like kinase 5，ALK5）受体结合，启动星形胶质细胞中的TGF-β信号通路，介导血脑屏障破坏和兴奋性突触传递[5]。此外，TGF-β还可通过调控星形胶质细胞介导的促炎因子、谷氨酸的释放，改变水离子通道诱发PTE[5]。综上所述，AQP4、TGF-β可成为司法鉴定实践中鉴定PTE的潜在生物标志物。

3 结构性生物标志物

神经细胞的结构性改变是导致PTE发生的重要机制，PTE的脑组织常伴有多种结构变化，包括神经元丢失、细胞增殖（如星形胶质细胞增生）和突触重组等。因此，TBI后神经细胞释放的各种特异性蛋白是诊断PTE的潜在生物标志物。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）作为中间神经元发育、维持、可塑性和抑制性传递的关键营养因子，与酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B，trkB）相互作用介导γ氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能的传递。GU等[20]研究表明，PTE实验小鼠脑组织中的BDNF水平降低，导致GABA能下降；BDNF/trkB信号传递受阻可导致中间神经元结构异常。随后，他们进一步证实，在注射trkB小分子激动剂LM22A-4进行治疗的实验小鼠体内，增强BDNF/trkB信号传递会引起GABA的上升，降低癫痫的发作次数和程度，提示BDNF具有抑制PTE的作用[21]。研究[21]还表明，BDNF与兴奋性传递、苔藓纤维发芽息息相关，这些机制均可能参与PTE的发生。因此，BDNF可能是法医学实践中灵敏性及特异性均好的PTE鉴定生物标志物。

NEUBERGER等[22]研究证实，TBI后神经发生会增加神经元兴奋性和癫痫易感性，而血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）与神经发生密切相关。反应性星形胶质细胞增生作为癫痫发作的高危因素[23]，可通过控制炎症细胞进入病灶、重建血脑屏障、降低氧化应激进而介导神经炎症，导致PTE的发生。因此，影响星形胶质细胞增生的因素，如表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）和内皮素1（endothelin-1，ET-1）等均可作为鉴定PTE的候选生物标志物[24]。

4 代谢性生物标志物

人类大脑消耗的能量占机体总能量的20%，其中80%～90%的能量供应于神经元活动。TBI后，大脑的能量代谢平衡遭到破坏。在星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭（astrocyte-neuron lactate shuttle，ANLS）模型中，星形胶质细胞作为主要代谢支持细胞，可通过转运蛋白参与谷氨酸的摄取，介导神经元兴奋性传递[25]。因此，上述调节星形胶质细胞的相关因子可能成为潜在的代谢性生物标志物。此外，已有研究[26]证实，脑葡萄糖代谢变化是TBI后许多不良转归（如PTE）的病理生理学基础。癫痫发作必然会导致葡萄糖代谢增加，介导氧化应激进而诱发PTE。因此，氧化应激的生物标志物，如羟基壬烯酸（hydroxynonenal，HNE）、缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和超氧化物歧化酶 2（superoxide dismutase 2，SOD2）均为潜在的代谢性生物标志物。并且该研究[26]表明，临床实践中可通过干扰葡萄糖代谢的靶点治疗PTE，提示代谢性生物标志物可作为PTE的生物分子标志物，但目前仍需寻找更多与PTE相关的可用于客观评定残疾的代谢性生物标志物。

5 总 结

PTE生物标志物的筛选面临一定的挑战，作为一种客观的诊断和鉴定标志物，应具备以下3个特点：（1）高度特异性、准确性和可检测性；（2）分析方法可靠且可重复测定；（3）能提供诊断和预后信息，以便法医学和临床工作者观察、诊断、判断预后。

尽管生物标志物在诊断、治疗及鉴定应用中有良好的研究前景，但仍有以下局限性：

（1）时间局限性。PTE可在TBI后不同时间点出现癫痫发作，目前尚不清楚上述病理生理学变化出现的准确时间，且即刻、早期PTE和晚期PTE的发病机制不同，因此，即刻、早期和晚期PTE中的潜在生物标志物可能存在差异。此外，一些神经炎症性生物标志物半衰期相对较短，可供检测的时间窗较短。

（2）样本局限性。在实际工作中，血清生物标志物具有可重复性、无创等优势，无疑是最好的选择。然而，一部分生物标志物可能只存在于CSF中，在血清或血浆中含量甚微，因此部分生物标志物的实际应用会受限。此外，中、重度TBI后导致血脑屏障开放，CSF中特异的生物标志物进入外周血，稀释了其在CSF中的浓度；中、重度TBI后出现脑水肿也会改变生物标志物在CSF中的浓度。因此，将CSF中生物标志物应用到PTE鉴定实践中，仍存在一定的困难。

（3）实验局限性。在实践中，年龄、性别是PTE的危险因素，然而现有的PTE动物模型实验往往未考虑实验动物的年龄和性别对PTE的潜在叠加影响。因此，通过动物实验确定筛选出的生物标志物并将其应用到人体PTE诊断中，仍需要大量的验证工作。

尽管将生物标志物应用于PTE鉴定实践存在局限性，但这些局限性也是PTE领域的研究方向。目前，生物标志物已广泛应用于肿瘤及非肿瘤疾病的临床诊断和治疗，随着分子生物学技术的日趋成熟，生物标志物在损伤、死亡等法医学领域也必然会成为研究的新兴热点。PTE生物标志物的筛选和确定，对PTE发病机制、预防、诊断、治疗及鉴定具有重要的临床和法医学意义。