m6A甲基化在非酒精性脂肪性肝病中的作用

骆云晨 彭永德

上海交通大学医学院附属第一人民医院内分泌代谢科 200080

随着肥胖症和体重相关代谢性疾病发病率的增加，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为慢性肝病的最常见原因之一。NAFLD通常被描述为代谢综合征的肝脏表现，包括一系列症状，从肝脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化和肝硬化，其特征是无其他肝脏疾病病因(如药物、病毒性肝炎和大量饮酒)的患者肝细胞中脂质积聚。NAFLD影响全球约四分之一的成年人口，对全社会造成重大的健康和经济负担，尽管在不久的将来有望出现药物疗法，但迄今为止尚未获得批准。近日，由于发病机制的异质性以及定义的不精确性，国际专家小组提出以代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)取代NAFLD，更好地反映对代谢功能障碍相关脂肪肝疾病的理解[1]。

NAFLD发生、发展的潜在机制是复杂和多因素的。目前多重打击假说已经取代了过时的“二次打击学说”。此假说认为，饮食习惯、环境和遗传因素会导致胰岛素抵抗、肥胖伴脂肪细胞增殖以及肠道微生物群的改变。代谢失衡与内质网应激、过度的氧化应激、脂毒性以及病原体相关分子模式(PAMPs)共同作用，导致肝细胞损伤和死亡。慢性坏死性炎性反应的发生启动了适应性免疫反应，最终导致肝细胞应激、DNA损伤、表观遗传修饰和染色体畸变[2-3]。表观遗传学的发展为NAFLD的发生以及肝细胞癌进展提供了新的视角。DNA甲基化被认为是从简单脂肪变性到NASH过程中重要的决定因素之一，5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是NAFLD中基因转录和细胞状态的标志物，其动态变化可能在肝脏疾病的发病机制中起重要作用[4]。由组蛋白去乙酰化酶和组蛋白乙酰转移酶介导的组蛋白乙酰化的改变是另一种常见的修饰，也是研究最多的修饰之一。沉默信息调节因子家族(SIRTs)是一类具有去乙酰化酶活性的蛋白质，特别是SIRT1，可调节参与代谢过程的蛋白质，如葡萄糖稳态、氧化应激、脂代谢和炎性反应。最近的研究表明，通过抑制CD36表达和核因子κB信号通路，SIRT1的激活减弱了高脂饮食诱导的肝脂肪变性和炎性反应[5]。微小RNAs(miRNAs)是调节转录后基因沉默的非编码RNA，miRNA-29和miRNA-122在调控NAFLD相关胰岛素抵抗中发挥重要作用[6]。最近的研究表明，m6A甲基化修饰对NAFLD的发展具有重要的调控作用。

1 m6A甲基化

m6A甲基化于1974年首次被发现，是高等真核生物RNA的主要内部修饰，近年来引起了人们的极大兴趣。真核生物m6A修饰在干细胞生物学、免疫学和癌症生物学过程中发挥重要作用。m6A甲基化可在不同环节调控mRNA，包括结构、成熟、稳定性、剪接、输出、翻译和衰变[7]。m6A修饰在哺乳动物细胞中是动态的并具有可逆性。甲基转移酶-3(METTL3)、甲基转移酶-14(METTL14)和Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)构成甲基转移酶复合物[8]。METTL3是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的一种结合亚基，与mRNA甲基化有关[9]。METTL3和METTL14可形成稳定的异二聚体，作为甲基化酶复合物的核心。由于存在甲基转移酶结构域，因此METTL3或METTL14的沉默均可降低m6A的表达水平[10]。WTAP作为调节亚基是形成METTL3-METTL14-m6A甲基转移酶复合物所必需的，它在调节基因表达和选择性剪接中起关键作用[11]。脂肪与肥胖相关蛋白(FTO)和ALKB同源蛋白5(ALKBH5)作为去甲基化酶来逆转甲基化。FTO可在体内外催化m6A残基去甲基化[12]。FTO参与m6A在不同细胞环境下的修饰，如紫外线诱导的DNA损伤应答、脂肪生成及急性髓系白血病细胞转化和白血病发生[13-14]。此外，ALKBH5对mRNA输出和RNA代谢有显著影响[15]。作为m6A相互作用蛋白的最重要成员，YTH结构域家族蛋白(包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2)通过识别m6A修饰来调节各种基因表达[16]。YTHDF1和YTHDF3促进mRNA的翻译，YTHDF2和YTHDF3促进mRNA的降解，YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3促进mRNA在细胞质中的代谢[16]。YTHDC1则介导m6A修饰mRNA，影响其核输出和剪接[17]。

2 m6A甲基化与NAFLD

2.1 m6A甲基转移酶复合物促进脂质沉积 甲基转移酶在脂肪形成中起着重要作用。METTL3通过促进脂肪酸合成酶(FASN)的m6A甲基化，促进脂肪酸代谢，降低肝脏胰岛素敏感性。Xie等[18]发现，高脂饮食喂养的小鼠m6A RNA甲基化和METTL3水平上调，METTL3基因沉默可降低FASN的m6A甲基化和总mRNA水平，进而抑制脂肪酸代谢。METTL3基因敲除小鼠中FASN过表达可改善胰岛素敏感性，使脂肪酸合成降低。最近的一项研究发现，由WTAP、METTL3和METTL14组成的甲基转移酶复合物在脂肪生成过程中通过促进有丝分裂克隆扩增(MCE)期间的细胞周期转变，在脂肪分化中起重要作用。WTAP与METTL3和METTL14在RNA中结合，在脂肪细胞分化中激活转录后调控。在MCE过程中，敲除这3种蛋白基因中的任一种都会导致细胞周期停滞和脂肪生成受损，从而抑制MCE中细胞周期蛋白A2(CCNA2)上调，抑制脂肪生成[19]。Zhong等[20]发现，METTL3通过减少过氧化物酶体增殖物活化受体α(PPARα)表达，增加脂质沉积。敲除METTL3基因可抑制m6A甲基化，使PPARα m6A甲基化含量减少，PPARα mRNA表达增加，脂质沉积减少。

2.2 m6A去甲基化酶促进脂肪生成 m6A去甲基化在脂肪生成的调控中发挥重要作用。FTO可通过改变肝脏中m6A修饰状态和脂代谢相关基因的表达在脂代谢调节中发挥作用。FTO在NAFLD患者肝脏及动物模型中表达增加[21-22]。Chen等[23]在高脂饮食喂养小鼠肝脏中发现，脂肪生成基因[乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)和FASN]的表达增加，而脂解基因(激素敏感性脂肪酶和甘油三酯水解酶)的表达减少。这些变化伴随着FTO水平升高和mRNA中m6A水平降低。在体外实验中也得到了类似的结果，FTO表达增强导致HepG2细胞中m6A水平降低，脂肪生成基因[FASN、硬脂酰-CoA去饱和酶(SCD)和单酰基甘油O-酰基转移酶1]和细胞内甘油三酯水平升高[24]。

FTO增加氧化应激水平，促进脂肪生成[21]。体外研究表明，FTO可能在脂毒性条件下对肝细胞产生损伤作用，敲除FTO基因可保护机体免受氧化应激、线粒体功能障碍、内质网应激和细胞凋亡的影响，提示抑制FTO可能是NASH的治疗选择之一[22]。Kang等[24]发现，FTO在体内外下调m6A的水平，降低线粒体DNA含量，增加甘油三酯的沉积。然而缺乏去甲基化活性的FTO突变体不能调节线粒体DNA和甘油三酯含量，表明FTO通过调节肝细胞中m6A水平来影响脂肪代谢。

FTO通过调控MCE过程来影响脂肪形成。Merkestein等[25]发现，FTO过表达(FTO-4)小鼠的原代脂肪细胞和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)具有更高的脂肪分化潜能，而来自FTO基因敲除(FTO-KO)小鼠的MEFs则显示出脂肪生成减少。Wu等[26]发现沉默FTO可通过在脂肪生成早期破坏细胞周期进程，抑制前脂肪细胞的脂肪生成。FTO沉默显著降低了细胞周期调节因子CCNA2和细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的表达，从而导致细胞周期延迟和脂肪形成抑制。

2.3 m6A相互作用蛋白逆转脂肪生成 在m6A相互作用蛋白中，YTHDF2通过m6A甲基化逆转FTO介导的脂肪生成。在3T3-L1细胞中，CCNA2和CDK2在MCE中起重要作用，FTO过表达和YTHDF2沉默显著增加了CCNA2和CDK2蛋白水平，改善了绿茶提取物(EGCG)抑制脂肪生成的作用[27]。敲除FTO基因后，CCNA2和CDK2 mRNA的m6A水平显著上调。m6A结合蛋白YTHDF2识别并降解CCNA2和CDK2的甲基化mRNA，导致蛋白表达下降，延长细胞周期，抑制脂肪生成[26]。此外，敲除YTHDF2基因导致PPARα mRNA的表达增加，脂质积累减少，提示PPARα的m6A甲基化是由YTHDF2介导的mRNA降解的关键调控机制[20]。

3 m6A甲基化在NAFLD中的临床意义

m6A甲基化在肝脏疾病的维持和进展中起重要作用，可能是一种潜在的治疗靶点。姜黄素是一种低分子量的多酚类天然化合物，存在于根茎植物姜黄中[28]。Lu等[29]发现姜黄素可降低脂多糖诱导的断奶仔猪中相对肝重的增加，使总胆固醇和甘油三酯水平降低，并且影响了METTL3、METTL14、FTO、YTHDF2 mRNA的表达，增加了仔猪肝脏中m6A的丰度，对肝损伤和肝脂代谢紊乱具有保护作用，具体机制仍需进一步研究。甜菜碱作为一种甲基供体的补充剂在NAFLD中也有一定作用。最近的研究表明，甜菜碱通过降低FTO的表达，改善肝脏m6A的甲基化状态，降低FASN和SCD mRNA以及甘油三酯水平，从而在NAFLD中起到保护肝脏的作用[24]。Zhang等[30]发现，甜菜碱通过介导FTO抑制肝脏脂肪积累并增加线粒体DNA含量和活性，表明甜菜碱参与脂质和能量代谢的调节。研究还发现，甜菜碱对小鼠肝脏脂肪变性的抑制作用与肝脏中AMP活化蛋白激酶的活化增加，调节肝脏葡萄糖和脂质稳态有关[31]。m6A修饰在与姜黄素或甜菜碱相关的肝脏疾病治疗中的作用和效果还需进一步研究。

综上所述，m6A甲基化修饰在NAFLD发生、发展中起着关键作用，m6A甲基化水平可能是早期诊断NAFLD的潜在指标，为未来该疾病在临床中的精确诊断和治疗提供一条新途径。