应用SS-PCR技术建立番石榴实蝇快速鉴定方法

黄 振,侯有明，郭琼霞

(1.福建农林大学 植物保护学院,福建 福州 350002;2.福州长乐机场海关,福建 福州350209;3.福州海关检验检疫技术中心,福建 福州 350001)

0 引言

番石榴实蝇Bactrocera(Bactrocera)correcta(Bezzi)属双翅目(Diptera)、实蝇科(Tephritidae)、寡鬃实蝇族(Dacini)、果实蝇属(Bactrocera)[1]。番石榴实蝇的分布范围很广,现主要在东南亚地区分布,如泰国、越南、缅甸、尼泊尔、印度、巴基斯坦、斯里兰卡等国家和地区。1989年,汪兴鉴等报道我国在云南(元江、漠沙)首次发现番石榴实蝇[2];2005年,朱振华等的报道中其番石榴实蝇样品采自云南河口[3]。1996年,梁广勤等报道我国台湾地区也有番石榴果实蝇发生[4]。1986年,美国的加利福尼亚州第一次发现了果实蝇,这也是整个西半球在野外首次捕捉到番石榴实蝇。番石榴实蝇的寄主种类很多,有番石榴、樱桃、桃、蒲桃、苹果、番荔枝、芒果、牛油果、人心果、莲雾、枣、腰果、石榴、扁桃、甜橙、丝瓜、苦瓜、木瓜、番茄、辣椒及柑橘类等30科60余种蔬菜和水果等。番石榴实蝇危害性大,是果蔬生产中的重要害虫[5]。

近几年,随着我国与国际农产品贸易交流和旅游业的快速发展,从境外输入和旅客携带入境的水果、蔬菜的批次、种类、数量明显增加,加上国际疫情复杂,导致检疫性实蝇传入我国的风险增大[6]。在进境的果蔬检疫中,口岸经常截获到实蝇类害虫,由于番石榴实蝇的形态特征与其同属其他种极其相似,尤其是经常截获到实蝇幼虫、卵或蛹,需饲养为成虫后才可进行传统的分类鉴定,所需时间周期长,饲养环境条件受限,影响了果蔬的进出境贸易和通关速度；而且现在对实蝇残体尚无法进行正确的识别。为了防止检疫性有害生物实蝇传入以及扩散,迫切需要开展有关实蝇快速鉴定识别技术的研究。

近年来,随着分子生物学技术的发展,该技术越来越多地被应用于昆虫不同虫态的分子鉴定中[7-8],它能解决传统的形态学分类方法难以解决的鉴定问题且不受虫态的影响。种特异引物PCR(Species-specific PCR, SS-PCR)技术在设计目标物种的引物时必须充分考虑引物的特异性,使得在扩增未知模板时能够根据目标片段条带的有无就能把目标种类与其他近缘种鉴别开来[9-10]。本研究提供了一种采用特异性引物快速鉴定番石榴实蝇的方法,该方法能够准确及时地对截获的疑似番石榴实蝇的卵、蛹、幼虫、成虫及残体等进行鉴定；此外,还建立了一种利用分子手段快速鉴定番石榴实蝇的方法[11]。

1 供试虫源

本实验的供试实蝇有:番石榴实蝇B.correcta(Bezzi)、杨桃实蝇B.carambolaeDrew & Hancock、辣椒实蝇B.latifrons(Hendel)、桔小实蝇B.dorsalis(Hendel)、具条实蝇B.scutellata(Hendel)、锈实蝇B.rubigina(Wang & Zhao)、腿端黑实蝇B.atrifemurDrew & Hancock、南瓜实蝇B.tau(Walker)、瓜实蝇B.cucurbitae(Coquillett)、瘤胫实蝇B.tuberculata(Bezzi)、黑膝实蝇B.scutellaris(Bezzi)、何氏华实蝇B.hochii(Zia)、枣实蝇CarpomyavesuvianaCosta、颜带实蝇B.cilifer(Hendel)、黑颜实蝇B.diaphoraCoquillett、近黑颜实蝇B.parater(Zhao & Lin)、五指山实蝇B.wuzhishanaLin et Yang, sp. nov.、滇寡鬃实蝇B.modica(Hardy)、瑞丽果实蝇B.ruiliensisWang, Long et Zhang, sp. nov.、瓜棍腹实蝇DacuslongicornisWiedemann等20种。实蝇的虫样均来自口岸进境果蔬检疫截获,并经实蝇鉴定专家复核；收集的实蝇虫样采用75%的酒精浸泡,放置于实验用的冰箱，备用。

2 试验方法

2.1 DNA提取与质量检测

2.1.1 模板DNA提取 本试验采用试剂盒法(OMEGA E.Z.N.A.TMInsect DNA Kit)进行DNA模板的提取。选取番石榴实蝇的蛹、幼虫或成虫的整只,或是其成虫的一条腿或是一片翅膀等身体部分,放置于2 mL离心管中,加入适量液氮进行充分研磨,具体操作步骤根据试剂盒的说明书；将得到的DNA样品直接保存于-20 ℃冰箱,备用。

2.1.2 DNA质量检测 利用通用引物上游LCO1490: 5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’和下游HCO2198: 5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’,对实蝇样本DNA模板的质量进行检测,在定量梯度PCR仪上进行PCR反应,体系为:2×EasyTaq PCR SuperMix (天根生化科技有限公司)12.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板各2 μL,加ddH2O至总体积25 μL。反应条件为:94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s,48 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共35个循环；最后延伸10 min。分别提取5 μL PCR产物在含DNA染色剂的1.5%琼脂糖凝胶多功能电泳仪上电泳30 min (120 V),采用凝胶成像分析仪进行检测,检查是否扩增出所需的目标片段,拍摄并记录结果。

2.2 引物设计

利用通用引物LCO1490和HCO2198对番石榴实蝇进行扩增并测序,测序由上海英潍捷基贸易有限公司进行,扩增番石榴实蝇的核酸序列为:

通过对番石榴实蝇的测序,采用NCBI数据库中提供的BLAST程序检查筛选同源性较高的序列,下载登录号的FASTA格式,利用Bioedit进行序列比对,然后根据SNP位点人工设计引物,再利用Oligo 6.44对引物进行评价,最后利用NCBI数据库中提供的Primer-BLAST程序检查同源序列。

2.3 引物的种特异性的测试

对所设计的引物进行种特异性的检验:选用除番石榴实蝇外的其它19种实蝇作为阴性对照,以番石榴实蝇为阳性对照,验证本实验所设计引物的种特异性。SS-PCR在定量梯度PCR仪上进行,反应体系为:2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL、引物各1 μL、模板各2 μL,加ddH2O至总体积25 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30个循环；最后延伸7 min。分别提取5 μL PCR产物在含DNA染色剂的1.5%琼脂糖凝胶多功能电泳仪上电泳30 min (120 V),利用凝胶成像分析仪检测是否扩增出预期大小的目标片段,拍摄并记录结果。

2.4 引物灵敏度的测试

利用核酸蛋白分析仪测试提取的番石榴实蝇DNA模板的浓度。将番石榴实蝇DNA模板按10-1、10-2、10-3倍梯度稀释后,使用种特异性引物FR447和FF463-486进行PCR扩增,测试该检测方法的灵敏度。

2.5 应用SS-PCR技术快速鉴定番石榴实蝇的应用与验证

利用福州机场旅客携带的，以及从福州、云南等口岸进境果蔬中截获的番石榴实蝇(将番石榴实蝇饲养到成虫并经过形态鉴定)的幼虫、蛹和成虫的部分虫体组织(成虫的一条腿、一片翅膀)共19份虫样,以提取的DNA为模板,使用种特异性引物FR447和FF463-486进行PCR扩增,来验证该方法的稳定性与准确性。

3 结果与分析

3.1 DNA质量检测结果

对供试的20种实蝇虫样提取的DNA模板,利用通用引物LCO1490和HC02198进行PCR扩增。结果均可见在长度约700 bp的位置扩增出1条单一、清晰的目标条带(图1)，表明所用通用引物可成功扩增供试的20种实蝇虫样提取的DNA模板。

M:50 bp DNA Ladder;1:番石榴实蝇;2:杨桃实蝇;3:辣椒实蝇;4:桔小实蝇;5:具条实蝇;6:锈实蝇;7:腿端黑实蝇;8:南瓜实蝇;9:瓜实蝇;10:瘤胫实蝇;11:黑膝实蝇;12:何氏华实蝇;13:枣实蝇;14:颜带实蝇;15:近黑颜实蝇;16:五指山实蝇;17:滇寡鬃实蝇;18:瑞丽果实蝇;19:黑颜实蝇;20:瓜棍腹实蝇;21:空白对照(ddH2O)。

图1 利用通用型引物LCO1490和HC02198对提取的实蝇DNA模板进行质量检测的结果

3.2 引物的选择

通过多重比对,最终选择的种特异性引物为FR447和FF463-486,引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。特异性引物FR447的序列为3’ACGTAGTGGAAATGAGCAACA5’; FF463-486的序列为3’CACAACCGTTATTAACATGCG5’。

3.3 引物的种特异性

通过凝胶成像分析仪进行检测，结果(图2)显示:仅番石榴实蝇在约645 bp位置扩增出1条清晰、单一的目标条带,其它的19种供试实蝇种类均未出现目标条带。该实验重复3次,检测所获得的目标条带均一致,表明该实验设计的种特异性引物FR447和FF463-486具有较强的特异性及稳定性。

将本实验所得到的PCR产物送到上海英潍捷基贸易有限公司进行测序,将测序所得序列提交给数据库(NCBI)进行BLAST,结果表明本检测所得的序列与数据库中的番石榴实蝇序列具有100%的一致性。

M:100 bp DNA Ladder；1:番石榴实蝇;2:杨桃实蝇;3:辣椒实蝇;4:桔小实蝇;5:具条实蝇;6:锈实蝇;7:腿端黑实蝇;8:南瓜实蝇;9:瓜实蝇;10:瘤胫实蝇;11:黑膝实蝇;12:何氏华实蝇;13:枣实蝇;14:颜带实蝇;15:近黑颜实蝇;16:五指山实蝇;17:滇寡鬃实蝇;18:瑞丽果实蝇;19:黑颜实蝇;20:瓜棍腹实蝇;21:空白对照(ddH2O)。

图2 引物FR447和FF463的种特异性验证结果

3.4 引物的灵敏度

采用核酸蛋白分析仪测试提取的番石榴实蝇DNA模板的浓度为55.97 ng/μL。取不同浓度的DNA模板测定最低检出阈值,结果(图3)表明:随着模板浓度的降低,所扩增出的条带逐渐减弱,在稀释10-1倍后仍有明显的条带,进一步说明该SS-PCR方法具有较高的灵敏度。

M:100 bp DNA Ladder；1～19:番石榴实蝇；20:空白对照(ddH2O)。图3 SS-PCR快速鉴定番石榴实蝇的应用与验证结果

3.5 SS-PCR快速鉴定番石榴实蝇的应用与验证

对截获的19份供试实蝇标本的虫样进行检测与验证,结果(图4)均发现了目标条带,表明采用SS-PCR方法的鉴定结果与形态学鉴定结果一致,该方法具有较好的稳定性,可以应用于检疫和监测中所获得的番石榴实蝇的鉴定工作。

4 讨论

本实验选用mt DNA COⅠ作为标记基因[10],筛选设计番石榴实蝇的种特异性引物,进行PCR扩增,仅番石榴实蝇能特异并稳定地扩增出长度约645 bp的清晰、单一的目标条带,其它实蝇种类均无目标条带出现,进一步验证了本实验所设计引物的特异性。然而当口岸仅发现卵或残体时,即只能提取到微量DNA时,SS-PCR检测鉴定方法的灵敏度就至关重要了。本实验所建立的方法具有较高的灵敏度,能检测到的DNA模板浓度可低至5.597ng/μL。同时,该SS-PCR检测鉴定方法在实际检疫工作中也得到了应用和验证。

M:100 bp DNA Ladder；1:稀释100倍；2:稀释10-1倍； 3:稀释10-2倍；4:稀释10-3倍；5:空白对照(ddH2O)。图4 引物GF85和GR531的灵敏度验证结果

综上所述,本文所建立的SS-PCR快速鉴定番石榴实蝇的方法,提供了一种灵敏的番石榴实蝇特异性检测引物,其能够检测各个龄期、各个虫态、多种组织状态的番石榴实蝇，并且能区分近缘种、属。本方法可以在8 h之内完成对番石榴实蝇的鉴定,具有快速简便、特异性高、灵敏度高等优点,能够满足口岸水果蔬菜检疫快速通关的要求。