水产品真伪鉴别与产地溯源检测研究进展

陈柔含，古淑青，钮 冰，邓晓军

(1.上海大学 生命科学学院 食品工程系，上海 200444；2.上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135)

水产品是世界上贸易最多的食品，随着人类对食物质量要求的日益增高，大西洋鲑鱼、鳕鱼等高值水产品的消费量逐年增大，在水产品的种类、来源、养殖方式、运输、加工、包装、标签等各个环节发生食品欺诈的概率也越来越高[1]。低值水产品冒充高值水产品，错误标签原产地，错误标记成分及成分比例等时有发生，不仅影响了消费者安全和权益，而且影响了整个食品工业发展。目前各个国家和国际组织已经制定了许多法规来防止掺假和食品标签的错误标识，水产品必须有“可追溯标签”，不得误标物种信息[2]。

图1 水产品真伪鉴别和溯源检测的分析方法

准确、可靠的分析方法是确定食品标识是否真实的前提。传统方法主要通过形态学方法判别新鲜或者未经加工的冷冻水产品，但无法辨认相似水产品及精加工制品，这就需要更加准确可靠的分析方法对食品真实性进行监测和控制。目前水产品真伪鉴别与溯源检测的常用方法主要有光谱、核磁共振(NMR)、酶联免疫(ELISA)、核酸检测、电泳、色谱及质谱等技术(如图1所示)。光谱技术能够快速、环保、无创地对肉制品进行光谱和空间成像，但受限于光谱范围和水分含量，且成本较高[3]。ELISA法可针对抗原抗体特异性结合并发生显色反应，但无法高通量检测，且假阳性概率高。核酸检测技术能直接从基因层面鉴别，但加工过程易使DNA变性损失。电泳法可对样品进行分离纯化和鉴定，但重现性较差。色谱法定性分析较弱。而质谱(MS)法可给出化合物的分子结构信息，在食品检测中的应用越来越普及，已成为当前国际检测领域中通用的“金标准”。目前，基于质谱的水产品鉴伪和溯源已有较多研究，主要利用同位素比值差异、小分子物质结构和含量差异以及蛋白质差异进行检测分析[4-6]。其中，基于质谱的蛋白质组学技术是近年来广泛关注的研究热点，通过高效液相色谱、毛细管电泳等分离手段结合电喷雾(ESI)、基质辅助激光解析(MALDI)等不同类型的离子化技术检测，在蛋白水平上进行物种鉴别和产地溯源。本文将就水产品鉴伪及溯源的最新研究进展进行论述。

1 水产品掺伪与溯源概况

掺伪主要包括掺假、掺杂和伪造。水产品掺伪主要指人为向水产品中非法掺入外观、物理性状或形态相似的物质以增加其重量或体积，或采用低值鱼代替高值鱼，如黑线鳕代替真鳕，虹鳟鱼代替三文鱼，巴沙鱼标榜为龙利鱼，从而降低成本获取利润[7]。长时间冷冻而皱缩的乌贼用水浸泡后恢复“新鲜”且有增重效果，小黄鱼放置过久变暗，用黄鳝血或黄粉涂抹改善色泽等行为，通过故意掺水或添加非法添加剂进行掺伪。

溯源是水产品安全管理的一个重要手段，产地溯源是其重要组成部分，有利于保护消费者权益，保护地区特色产品，确保公平竞争，并且能够在突发环境污染、疫病疫情等食品安全事件时，有效召回产品[8]。比如新西兰南岸沿海和南极圈之间鳕鱼资源丰富，生长环境好，因此该地产出的鳕鱼纯正、营养最佳，时有其他地区鳕鱼冒充新西兰鳕鱼进行销售，欺骗消费者。“阳澄湖大闸蟹”、“波士顿龙虾”、“阿拉斯加帝王蟹”等均属于地域特色性水产。溯源技术的出现使得产品得到监管和保障，许多国家已经建立了相关可追溯体系及法律法规。

2 水产品真伪鉴别与溯源检测方法

现代分析方法已经广泛应用于水产品的真伪鉴别与溯源检测方面，光谱法、ELISA及核酸检测通过靶标物质鉴别真伪，电泳、色谱和质谱等方法具有强大的分离分析能力，在掺假检测基础上可进一步定量，而核磁共振及同位素质谱技术对水产品溯源具有很大帮助。

2.1 光谱法

基于振动光谱学的近红外(NIR)和拉曼光谱(Raman spectroscopy)分别通过电磁辐射吸收和拉曼散射测定分子振动信息得到光谱图，结合高光谱(HSI)成像技术可以得到空间图像信息，具有无损、快速和准确的优点，通常用于食品认证和质量控制[9]。Alamprese等[10]用NIR法根据不同鱼种的红外吸收峰不同，准确鉴别了两对相似的鱼种，鲻鱼和红鲣、鲽和偏口鱼。NIR结合HIS可用来区别新鲜和冷冻鳕鱼片，但灵敏度较低，不适合做痕量分析[11]。Hikima等[12]开发了一种拉曼光谱法用于检测鲑鱼片中的虾青素含量，通过计算虾青素/(蛋白质和脂肪)的相对强度比值能有效区分大西洋鲑、银鲑和红鲑。拉曼与近红外光谱互为补充，可以鉴别特殊结构或特征基团，但在定性的准确性和定量的灵敏度方面有待于进一步提高。

荧光光谱是通过荧光标记氨基酸、核酸、NDAH和一些氧化产物，根据物种、地理来源和加工条件来评估鱼类的新鲜度及类别[13]。

2.2 核磁共振波谱法

核磁共振波谱(NMR)法是将核磁共振现象应用于分子结构的测定，其原理是微观粒子吸收不同能量的电磁波后可在不同能级上跃迁，从而表现出核磁共振谱图的吸收峰位置、强度和精细结构不同。近年来高分辨核磁共振波谱仪的出现为食品中的代谢物提供了高通量光谱/结构信息。NMR法可借助分析有机物中13C、1H等元素来区分野生和养殖鱼类，从而进行地理溯源[14-17]。法国阿基坦鱼子酱久负盛名，常被其它产地的鱼子酱冒用，Heude等[18]通过1H NMR对代谢物进行光谱分析，运用多变量统计模型对阿基坦鱼子酱和意大利、中国、乌拉圭地区的鱼子酱进行了区分。NMR法的最大优势是能通过同分异构体得到物质结构式，且提供的原子层面信息远大于红外光谱，但该方法仪器价格昂贵，灵敏度较低。

2.3 酶联免疫法

酶联免疫(ELISA)法是通过将抗原或抗体固定化和酶标记，根据颜色反应来判定的分析方法。东大西洋石斑鱼和多锯鲈为两种高值鱼，Asensio等[19]采用间接法对餐馆中的44个鱼粉样品进行ELISA检测，发现29份样品为假冒产品。Santaclara等[20]建立了多重PCR-ELISA方法，DIG标记后的PCR产物用于ELISA测定，出现蓝绿色则为金枪鱼，能有效将金枪鱼与代替物种区分开来。此外，ELISA和电泳等方法可结合使用，Liang等[21]将ELISA和SDS-PAGE结合统计得出小清蛋白免疫反应强烈程度与其含量之间的相关性，并通过不同的小清蛋白特异性抗体来鉴别南半球鱼的物种。

目前ELISA法已经发展成为商业试剂盒，具有很强的专一性，但无法进行高通量检测，稳定性和重复性也较差，易发生交叉反应。

2.4 核酸检测技术

DNA含生物体所有遗传信息，基于核酸的分析技术能最本源地区分相似水产品。细胞色素C氧化酶I(COI)在不同鱼种具有特异性，通过基因条码COI建立可靠的DNA指纹图谱可用于快速鉴伪[22-25]。Taboada等[26]开发双重PCR-ELISA方法可正确鉴别3种不同类型鳕鱼(Molvamolva、Gadusmorhua、Gaduschalcogrammus)。Molkentin等[27]用等电聚焦分离鲑鱼水溶性蛋白质，PCR扩增分析有机、养殖和野生型鲑鱼。Fernández-Pérez等[28]开发了基于5S rDNA和ITS区域的PCR-RFLP法鉴别4种欧洲斧蛤，方法高效、快速、简单，对溯源具有一定参考价值。转基因水产品也是掺假的一种，实时荧光定量PCR设计内源基因靶标来检测DNA，而非转基因样品无检测信号，从而做出可靠判断[29]。可视芯片是一种利用特异探针杂交产生可见信号的基因芯片技术，韩建勋等[30]采用该技术建立了一种常见鱼源性成分的高通量快检方法，为标签认证和鱼肉溯源提供了快速、有效的技术支持。Rasal等[31]基于单核苷酸多态性(SNP)建立了二代测序高通量测序技术，得到22种鱼类的遗传差异并对其进行了准确分类。

核酸检测技术关键是分析具有种间差异的可靠核酸片段，但高温烹饪及干燥等加工过程会对DNA造成一定损失，需进一步探索。

2.5 电泳技术

电泳作为近现代高分辨分离技术，利用带电粒子在电场中分离的原理，随着基因组学、蛋白质组学的发展，凝胶电泳、双向电泳、毛细管电泳技术应运而生，尤其是毛细管电泳已成为分离DNA片段的重要工具和首选方法[32]。毛细管电泳以毛细管为分离通道进行快速分配，其分析效率高，在蛋白分析中得到广泛应用[33]。但毛细管电泳法的进样量少、检测光程短，可通过结合化学发光检测提高方法的灵敏度[34-35]。Walker等[36]基于芯片的微流体电泳分析鱼类肌肉蛋白并分类，能显著区分鲶鱼、鲷鱼、石斑鱼以及非法替代品，灵敏度、特异性和准确度均大于98%。

2.6 色谱技术

色谱主要是将各种化合物分离后进行定性、定量分析，常见的色谱技术包括气相色谱(GC)和液相色谱(LC)技术。水产品中通常含有大量脂质、脂肪酸(如ω-3脂肪酸、甘油三酯(TG))，常用反向高效液相色谱(RP-HPLC)来鉴别真伪[37]。油鱼(Ruvettuspretiosus)油脂含量极高，且不被人体消化，不法商贩用其替代鳕鱼被消费者食用后易出现腹泻等症状，Nichols等[38]采用气相色谱和薄层色谱法对富含油脂鱼类进行分析，发现其含有大量非皂化性脂质，对人体健康存在威胁。将色谱与质谱技术进一步联用可提高灵敏度和准确性，从而实现精确定量。

2.7 质谱技术

2.7.1 基于同位素的质谱技术不同种类及来源的水产品同位素比值(δ)因受气候、环境、生物代谢等因素影响而存在差异，因此，可借助同位素组成来鉴定水产品真伪与溯源。Carrera等[39]测定了13种主要商业鳕鱼δ13C和δ15N，结果表明不同地理位置，其同位素比值存在差异。Gopi等[40-41]通过连续流质谱(CF-IRMS)得到δ13C和δ15N，可区分盲曹鱼、斑节对虾的产地来源，结合Itrax XRF区分养殖和野生捕获的斑节对虾，其准确度可达90%和95%。地理位置结合饲料喂养差异性也能精确溯源，Camin等[42]测定虹鳟鱼中H、C、N、O和S同位素比值，量化地理和营养物质关系，可有效评估地理来源。由于各养殖场饲料组成不同，结合脂肪酸和同位素可以精确溯源[43]。Zhang等[44]采用同位素比质谱(IRMS)结合脂肪酸组成对不同采样点的野生海参进行差异分析，以实现准确分类与溯源。将元素标记电感耦合等离子体质谱仪(FI-ICP-MS)用于检测样品中的蛋白质、多肽和脂肪酸，具有高灵敏度和选择性，对保护地域特色物种具有重大参考价值[45-46]。

2.7.2 基于脂肪酸的质谱技术水产品中的脂肪含量很高且不尽相同。液相色谱-电喷雾串联离子阱质谱法(LC-ESI-MS/MS)已广泛应用于植物油中TG的结构解析，2010年有研究者[47]将该法应用于鳕鱼肝油的鉴伪，通过TG分子基本结构特征及其碎裂机制来判别产品真伪。Black等[48]用快速蒸发离子化质谱(REIMS)实时检测鱼类的脂肪种类和含量确定物种，但仪器成本较高。GC-MS仍然是迄今为止用于分析脂肪酸的最常用和最可靠的方法，但由于脂肪酸的低挥发性易导致难以定量或灵敏度较差，需衍生为脂肪酸甲酯以便色谱分离。Borden等[49]用凝相薄膜导入质谱法(CP-MIMS)直接表征鲑鱼组织中的脂肪酸，并添加了甲醇改性剂以提高对较长链脂肪酸的分析性能，对食品认证和营养分析具有重大意义。

图2 LC-MS/MS(A)及MALDI-TOF MS(B)法检测水产品真伪

2.7.3 基于蛋白质的质谱技术基于蛋白质组学的质谱技术已被广泛用于食品质量认证，具有高通量、高灵敏度且不易受生产加工影响的优势，按技术路线可分为“Bottom up”和“Top down”两种。“Bottom up”也称“鸟枪法”，其工作流程通常是胰蛋白酶酶解出特征肽段进入质谱分析[50-51]。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)为常用分析方法，其步骤如图2A所示，小清蛋白(RPVB)[52-54]、精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)[55]以及特异性蛋白[56-57]均可用作标记物来鉴别鱼类和虾类。“Top down”的蛋白质组学工作流程是将蛋白质提取物直接进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析，产生的高丰度蛋白质指纹通过与数据库比对来鉴定属和种，高效简单，其原理如图2B所示[58]。2013年，商业用MALDI-TOF MS在物种水平上对72个虾样本进行鉴定，准确率达到97%[59]。MALDI-TOF MS和PCR方法同时鉴定扇贝，两者结果一致，但前者更高效、快速和准确，具有强大的发展前景[60]。MALDI-TOF MS还可根据鱼眼玻璃体液[61]和肌肉组织[62]分析鱼体新鲜度及加工方式。MALDI-TOF MS作为非选择性检测方法，可为每个样品创建指纹和建立物种鉴别数据库，有望能取代DNA测序成为最佳的物种鉴别方法[63]。

蛋白质定性有助于鉴定和表征样品中全套蛋白质从而达到鉴别真伪的目的。食品加工和储存过程造成蛋白质翻译后修饰会影响其活性和稳定性[55]，如羰基化、美拉德反应、缩合反应等，具备特异性。两种常见的蛋白质定性方法是肽质量指纹图谱(PMF)和肽片段化指纹图谱(PFF)，前者通过纯化蛋白进入MS/MS检测后产生的一种或多种肽段进行鉴定，而PFF则采用2-DE分离出未知蛋白质，酶解后进入质谱分析[64]。Barik等[65]通过2-DE结合 MALDI-TOF MS研究月尾鳠(Sperata seenghala)和剑鳠(Sperata aor)两种相近诺鲿的肌浆肽差异，结果表明磷酸丙糖异构酶在两种诺鲿中具有特异性，从而进行鉴别。Gerbig等[66]用解吸电喷雾电离质谱法(DESI-MS)分析欧洲5种常见错误标识鱼(鳕鱼、鲑鱼等)的非挥发性代谢物并正确鉴别真伪。Nessen等[67]分析5种不同比目鱼肌肉组织的酶解肽段碎片谱图，并通过对比物种谱库完成了物种鉴定。食品加工业中物种数据库缺少，导致食物掺假事件发生，这就需要完善已有的数据库。目前水产品相关数据库主要有GPM、Uniprot、PRIDE、华大基因、Matrix Science、NCBI等。

蛋白质组学质谱法还可用来定量分析，筛选物种特征肽段在多反应监测扫描(MRM)模式下的量化掺假。Marchis等[68]通过选择特征肽，建立LC-ESI-MS/MS方法在MRM下分析牛、猪、水产品和乳制品加工产品，可有效监测肉制品掺杂，最低检测限为1 nmol/L。Hu等[69]则针对日本、中国和凡纳滨产地对虾，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF MS)选出3种虾的特征肽作为定量肽段，其特征肽大多来自肌球蛋白、精氨酸激酶和血蓝蛋白。Sun等[70]建立LC-MRM-MS/MS方法分析小清蛋白，发现了比目鱼的小清蛋白特征肽段，据此可检测不同食品基质中比目鱼的含量，最低检测限为0.02 μg/g，定量限为0.10 μg/g。

2.8 其他方法

传感器作为水产品质量和真实性评估的新兴方法，具有广大的应用前景[71]。Handy等[72]结合DNA微阵列与中红外成像，观察杂交斑点并用拉曼光谱进一步表征，可正确识别7种鲶鱼及其代替物种。Ulrich等[73]基于实时核酸序列依赖性扩增技术(RT-NASBA)设计手持传感器，以线粒体16S rDNA基因区域来区分石斑鱼和替代鱼类，方法快速便捷。

表1～2分别列出了部分方法在水产品的真伪鉴别与溯源检测方面的应用。

表1 水产品真伪鉴别方法

COI:cytochrome oxidase I,DIG:digoxin,PCR:polymerase chain reaction,RFLP:restriction fragment length polymorphism analysis,DESI:desorption electrospray ionization

表2 水产品溯源检测的方法

PCA:principal component analysis;OPLS-DA:orthogonal projection on latent structure-discriminant analysis;ANOVA:analysis of the variance;δ13C:stable isotope ratios of C;FA:formic acid;LFQ:label-free quantitation;IRMS:isotope ratio mass spectrometer;CF-IRMS:continuous-flow isotope ratio mass spectrometer;PLS-DA:partial least squares-discriminant analysis;LDA:linear discriminant analysis;ICP-MS:inductively coupled plasma mass spectrometer;SVM:support vector machine

3 结论与展望

分析技术的发展促进了水产品真伪鉴别与溯源检测技术的创新，保证水产品质量安全的需求也正成为分析方法提升的强大动力。色谱-质谱技术具有高稳定性、高灵敏度以及高通量的特点，能够对特征组分进行准确鉴别和精确定量，日益成为水产品真伪鉴别和溯源检测的核心，同其它分析技术相互补充，有力保障了水产品质量安全。但基于色谱-质谱技术的真伪鉴别和溯源研究也存在以下局限性，如：一般需要较为复杂的前处理过程以提纯靶标物质使其适于色谱-质谱检测；确证相近物种或产地来源的特征组分较为困难，需要大量真实样本以保证所建方法的准确性。综上，后续研究的重点将会聚焦于：①建立快速、自动化、高通量的样品前处理方法；②结合化学计量学建立水产品真伪鉴别和溯源检测模型，以进行非靶标模式判别；③建立动态化真实样本数据库和判别规则，以实现水产品真伪和产地的智能识别。