元素含量分析应用于樱桃产地溯源

卢 丽，刘 青，丁 博，李志勇*，李波平，关丽军，谢湘娜

(1.广州海关 广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室,广东 广州 510623;2.广州医科大学 药学院，广东 广州 511436)

樱桃酸甜可口、营养丰富，备受国人青睐。它们在广东及香港地区被直译为“车厘子”，即英语单词“Cherry”(樱桃)的音译，但并非指中国樱桃，而指产于美国、加拿大、智利等美洲国家的个大、皮厚的进口樱桃。樱桃色泽鲜艳、晶莹美丽，加之果实富含糖、蛋白质、维生素及钙、铁、磷、钾等多种元素，使其成为一种价值较高的特色进口水果之一。2014年中国已成为樱桃进口量第三大国，樱桃进口额世界第一[1]。

中国目前也有车厘子果树的引种，山东、大连的部分品种樱桃在外观上与进口车厘子基本一样，难以肉眼区分。不法商家为获得更大的市场利益，以次充好以及假冒产地的情况时有发生，严重影响了行业的健康发展及消费者利益。因此，高价值特色农产品原产地鉴别技术的研究越来越多引起研究者的关注。

近年来，利用现代分析技术对农产品进行产地鉴别有较多报道[2-4]。矿物元素指纹图谱技术可通过分析不同来源生物体中矿物元素的组成和含量，再利用方差分析、聚类分析和判别分析等数理统计方法筛选出有效指标，进而建立判别模型和数据库，实现农产品的溯源和确证[3]。目前，用于产地溯源的矿物元素分析方法有电感耦合等离子体质谱法(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)和电感耦合等离子体发射光谱法(Inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy,ICP-OES)[5-21]。本文利用ICP-MS和ICP-OES测定樱桃中51种元素含量，并基于化学计量学中主成分分析(Principal component analysis,PCA)和偏最小二乘法-判别分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)法建立了美国、加拿大、中国3个产地樱桃的判别模型。该技术的建立可为规范中国樱桃消费市场，提高相关部门的反欺诈监管水平，维护消费者权益，具有良好的社会和经济效益。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

92份樱桃样品分别来自美国(50个)、中国(31个)和加拿大(11个)。其中11个加拿大及20个美国样品为广州机场口岸进口，其余为广州大型超市、百果园水果超市或淘宝原产地购买而得。

浓硝酸(UP级，质量分数68%，苏州晶瑞公司)；实验用水为超纯水(电阻率>18.2 MΩ·cm,20 ℃)；43种ICP-MS多元素标准溶液IV-ICP-MS-71A(10 μg/mL,iNORGANic Ventures)；多元素标准溶液IV-CCS-5(100 mg/L,iNORGANic Ventures)；16种元素ICP-MS混标(100 mg/L,O2si)；定制3种元素ICP-MS稀土内标混标Re、Rh、In(100 μg/mL)均购自上海安谱实验科技股份有限公司。锂(100 μg/mL，中国计量科学研究院)；钠、镁、磷、钾、钙(1 000 μg/mL，中国计量科学研究院)；生物成分分析标准物质GBW10021(GSB-12豆角)和GBW10020(GSB-11柑橘叶)均购于国家标准物质网。含有Ba、Be、Ce、Co、Li、Mg、Rh、U的调谐液(10 μg/mL)购于美国珀金埃尔默仪器公司。

1.2 仪器与设备

Pro Blends 5匀浆机(飞利浦)；MS 303TS/02型电子天平(美国梅特勒-托利多公司)；Milstone超级微波消解仪(意大利Milestone公司)；Milli-Q超纯水系统(Millipore公司)；Perkinelmer SPB·50-48石墨消解仪、PE ELAN-DRC-e电感耦合等离子体质谱仪、PE 5300电感耦合等离子体发射光谱仪(美国PE公司)。实验所用消化管为石英材质，尽量不使用玻璃材质器具。

1.3 实验方法

1.3.1 样品采集2018年5月～8月，收集广州机场口岸进口的美国和加拿大产区樱桃样品，同时在广州永旺、百佳、CASMIA TASTE等大型超市或淘宝原产地，以约每周一次的频率购买美国或国产樱桃样品。

将收集到的樱桃样品先用去离子水洗净，沥干水分，去核，将果肉放入匀浆机搅拌成匀浆，待测。

1.3.2 样本消解及元素含量测定参考GB 5009.268-2016食品中多元素检测方法[22]，准确称取1.0 g樱桃匀浆样品于石英消化管中，加入3 mL浓硝酸，放入超级微波消解仪中，采用程序升温法进行超级微波消解，待消解完成后，再放入石墨消解仪以130 ℃加热赶酸约2 h，最后用去离子水转移样品，定容至25 mL。采用同样方法制备试剂空白和质控样品。

1.3.3 数据处理用SIMCA软件对数据进行主成分分析(PCA)和线性判别分析(PLS-DA)，比较不同产地樱桃中矿物元素的差异显著性，建立樱桃产地判别模型，鉴别樱桃产地来源并验证产地判别效果。

2 结果与讨论

采用ICP-MS和ICP-OES测定樱桃样品中Be、B、Na、Mg、Al、Si、P、K、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Ag、Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Pb、Th、U、Tl共51种矿物元素的含量。其中，Na、Mg、P、K、Ca用ICP-OES检测，其它元素用ICP-MS检测，均采用外标法定量。ICP-MS用内标元素Rh和In保证仪器的稳定性，每个样品重复测定3次。用生物成分标准物质GBW10021(GSB-12豆角)和GBW10020(GSB-11柑橘叶)作为质控样，对质控样中没有参考值的元素Ga、Zr和Nb以及特殊元素Al和Si进行6次平行测定的加标回收试验，作为测试方法准确性的判定依据。

2.1 方法准确度及精密度

GBW10021(GSB-12豆角)和 GBW10020(GSB-11柑橘叶)测试结果见表1。由表1可见，除了铝和硅2种元素检测值低于证书给定值外，其他各待测元素的测定值与标准证书值相吻合，相对标准偏差(RSD)均不大于10.33%。硅和铝因其存在形式和元素本身的性质，在只用硝酸不加氢氟酸的微波消解条件下难以全部以游离态离子溶出，故只检出酸可溶性硅和铝的含量。采用加标回收的方法验证Al和Si以及生物成分标准物质缺少的Ga、Zr、Nb。这5种元素6次平行测试的加标回收率为90.6%～99.4%，RSD为2.5%～9.0%。从质控样及加标回收检测结果可知，该方法测定樱桃样品中51种元素具有良好的准确性和精密度。

表1 生物成分标准物质证书值及检测结果(n=3)

(续表1)

Elements(10-6)GBW10021(GSB-12 beans)certificate valueMeasured valueRSD/%GBW10020(GSB-11 citrus leaves)certificate valueMeasured valueRSD/%Si∗(0.27)0.049 59.470.41±0.080.045 013.8Sm∗∗29±428.96.4380±7752.18Sn(0.2)0.1879.083.8±0.53.821.08Sr55±352.42.50170±101750.76Tb∗∗4.1±0.53.641.9411±19.610.75Th0.055±0.0100.059 47.230.14±0.020.1281.45Ti21±419.60.5138±1028.30.89Tl∗∗4.2±0.83.481.1460±8560.26Tm∗∗1.8±0.31.545.533.8±0.92.970.78U∗∗90±585.52.1845±1038.71.02V0.51±0.060.5104.001.16±0.131.102.16Y0.155±0.0170.1493.420.42±0.040.4003.23Yb∗∗11±29.165.3825±523.01.67Zn32±231.79.1118±216.10.11

*indicate the unit is 10-2，**indicate the unit is 10-9

2.2 不同产地樱桃溯源模型的建立

2.2.1 不同国家樱桃样品的分布情况农产品产地溯源鉴定研究中，样品的来源真实性问题决定产地溯源鉴定模型的准确性，其评估方法主要有地理标签标记和样品成分分析两种方法，本文采用样品成分分析法评估樱桃样品来源的真实性。研究选择植物生长过程中必需的大量元素Mg和Ca以及微量元素Mn、Fe和Zn为代表元素，依据樱桃样品中此5种元素含量来评估美国、加拿大和中国产地来源的样品代表性问题，根据实验数据的统计分布描述方法之一的QQ图，判断3个产地来源样品是否符合正态分布，以评估樱桃样品的来源真实性问题。基于31个中国样品、50个美国样品和11个加拿大样品中Mg、Ca、Mn、Fe和Zn元素含量，发现3个国家样品中矿物质含量数据呈正态分布，以植物大量必需元素Ca和微量必需元素Fe的QQ图进行解释(图1)。由图可知，中国、美国和加拿大三地区来源的樱桃样品中必需元素的含量数据呈线性关系，该规律表明3个国家来源的樱桃样品呈正态分布趋势，由此推测从国内海关口岸、市场及樱桃生产基地购买的样品具有一定代表性，样品的来源真实性比较可靠，可用于产地溯源模型的鉴定研究。

图1 不同国家樱桃样品中典型代表大量必需元素Ca与微量必需元素Fe含量的QQ图分布

2.2.2 不同产区样品矿物元素含量分析对中国、美国和加拿大来源的樱桃样品进行ICP-OES和ICP-MS分析，51种矿物质元素含量见表3。樱桃样品中大量必需元素Mg、Si、P、K和Ca，以及微量必需元素B、Na、Fe、Mn、Cu、Zn的含量均在1 mg/kg以上，而Mo和Ni两种微量必需元素含量比较低，尤其是Mo元素，除了加拿大樱桃的Mo含量在22 μg/kg左右外，其余两产地樱桃中Mo含量均低于10 μg/kg。樱桃样品中非必需元素中除Al外，其余非必需元素含量均较低。进一步研究发现，不同地区樱桃样品中单一必需元素含量在相同的数量级范围内，因此单一元素含量信息无法判别样品的产地来源，需开展多元素含量分析，构建樱桃样品的产地溯源鉴定模型。

表3 不同地区樱桃样品中矿物元素含量

*indicate the unit is mg/kg;-:no detected

图2 PCA 判别模型

2.2.3 PCA主成分分析由表3可见，同一元素在不同国家间以及同一地区不同批次间样品标准偏差较大，表明选择此51种元素作为研究对象时，单一元素因素组内和组间差异显著，不能通过某1个或几个元素进行产地来源的鉴定，需根据樱桃中51种元素含量分布情况，进行多元统计分析来鉴别樱桃产地。将不同产地樱桃中51种元素含量数据进行主成分分析(PCA)，结果见图2。由图可见，除2个美国樱桃和2个加拿大樱桃样品离群外，中国与美国、加拿大两国产地来源的樱桃具有不同的聚集效应，因美国与加拿大地域相近，其樱桃样品分布区域相同，而中国与两者的地理位置相距甚远，使得樱桃样品分布区域显著不同。由此可通过樱桃中金属元素含量分布情况，进行樱桃产地来源判别。另外，4个中国产地樱桃样品分布到美国加拿大区域，推测可能是产地信息标记错误。

图3 PLS-DA 判别模型

图4 PLS-DA 模型的元素VIP值分布情况

图5 优化后PLS-DA产地溯源鉴定模型

2.2.4 PLS-DA判别分析为进一步优化樱桃产地溯源的判别模型，将93个樱桃样品的51种元素含量进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，构建不同产地樱桃的PLS-DA鉴定模型(图3)。由图可知，与PCA鉴定模型相似，PLS-DA模型中不同国家产地来源樱桃样品也具有一定聚类效应；其中美国和加拿大樱桃样品有一定区分，但无法显著区分；而中国樱桃可显著区分美国、加拿大两国。与PCA模型一样，也有4个中国樱桃样品分布到美国加拿大区域之内，推测可能是样品来源信息标记错误导致。

51种元素含量信息显示PLS-DA模型变量参数比较多，需优化减少模型的变量参数。本研究通过变量对模型的重要性指标(VIP)来优化模型的变量数目，以减少金属元素变量(图4)。由图4可知，以VIP>1的元素为显著变量，确定PLS-DA模型的显著变量元素有Pr、Nd、Ce、Y、Co、Mo、Mn、Dy、Gd、Ni、Ho、Sm、Sr、Er、Ga、U、Na、Yb、Be和Zn。其中Mo、Mn、Zn是植物必需营养元素，Co和Na是植物可能必需营养元素,Pr、Nd、Ce、Y、Dy、Gd、Ho、Sm、Er、Yb为稀土元素,Be和Sr为碱金属元素。由此可知，在16个植物必需元素中，樱桃对其中的Mo、Mn、Zn 3个必需营养元素吸收差异显著，对钠和钴2个可能必需营养元素吸收差异显著；此外，樱桃对10个稀土元素的吸收差异也比较显著。以此20个显著元素变量构成的PLS-DA鉴定模型分析结果见图5。

由图3和图5可知，PLS-DA产地溯源鉴定模型中元素变量参数优化前后，产地溯源鉴定模型结果基本一致，由此推测此20种元素变量为主要贡献率成分，在后续樱桃样品PLS-DA产地溯源模型构建过程中，仅需检测分析此20种元素的含量信息，即可构建樱桃样品产地溯源鉴定模型。

2.2.5 不同产地樱桃产地溯源模型中主成分贡献率元素以PLS-DA模型分析所得20种显著性的元素含量数据进行PCA分析(图6)。研究表明，PCA产地溯源鉴定模型与PLS-DA结果一致，说明挑选出的20种显著性元素含量信息均可应用于两种模型鉴定中国与美国、加拿大两地的樱桃样品。由图6B可见，美国和加拿大2个产地樱桃样品的溯源鉴定模型中主成分贡献率元素为Mo、Ga、Sr和U；而中国产地樱桃样品的溯源鉴定模型中主成分贡献元素为Pr、Nd、Ce、Y、Co、Mn、Dy、Gd、Ni、Ho、Sm、Er、Na、Yb、Be和Zn，其中又以稀土元素为主，这可能与樱桃样品来源有关，中国樱桃样品主要来源于稀土元素矿产资源主要分布地区之一的山东省，导致山东樱桃样品中稀土元素含量较高，与美国、加拿大两国樱桃样品相比，中国樱桃中稀土元素含量比较显著。

图6 优化后樱桃样品的PCA产地溯源鉴定模型的分析结果

优化后樱桃产地溯源鉴定PCA模型中20种元素的第一主成分和第二主成分的方差贡献率如下：

t[1]=0.184Be+0.075Na+0.230Mn+0.256Co+0.234Ni+0.152Zn-0.126Ga-0.149Sr+0.284Y-0.112Mo+0.298Ce+0.298Pr+0.292Nd+0.248Sm+0.263Gd+0.279Dy+0.247Ho+0.241Er+0.183Yb-0.090U;

t[2]=-0.012Be+0.024Na-0.282Mn-0.173Co-0.240Ni-0.177Zn-0.552Ga-0.218Sr-0.112Y-0.040Mo-0.048Ce-0.095Pr-0.105Nd+0.107Sm+0.102Gd-0.018Dy+0.057Ho+0.188Er+0.360Yb+0.249U。

图7 优化后樱桃样品的PCA产地溯源鉴定模型的三维示意图

采用优化后PCA鉴定模型的第一主成分和第二主成分以及中国、美国和加拿大樱桃构成三维PCA模型(图7)，结果显示，3个产区三维图与二维图一样，均可显示出中国产地樱桃显著不同于美国和加拿大。

2.3 产地溯源PLS-DA模型对未知产地樱桃样品的识别率

选择2018年和2019年收集的20个樱桃样品作为鉴别模型的盲样验证样品，分别是6个加拿大样品(1个2019年样品)、8个美国样品(3个2019年样品)和6个中国样品(2个2019年样品)，利用构建的2018年樱桃样品PLS-DA产地溯源鉴定模型预测判断20个样品的产地来源。结果显示，该模型可正确鉴定5个加拿大产地样品，4个美国样品和5个中国样品；对加拿大、美国、中国3个产地样品识别率分别为83.3%、50%、83.3%。进一步分析发现，PLS-DA产地溯源鉴定模型对2019年收集来源的1个加拿大样品、3个美国样品和1个中国样品，预测识别错误；由此可知，樱桃的产地溯源模型识别率还与样品的年份密切相关。

3 结 论

采用ICP-MS和ICP-OES多元素分析技术，对美国、加拿大、中国3个产地92个樱桃中的51种元素进行了测定，根据试验数据的统计分布描述方法之一的QQ图，判断三产地来源的样品符合正态分布，确立樱桃样品的来源真实可靠，并进行PCA和PLS-DA分析，成功建立了判别模型，并通过PLS-DA模型的VIP值优化樱桃样品中元素变量数目，将模型变量降至20种元素；发现中国产地来源的樱桃样品中稀土元素含量显著高于美国、加拿大。该方法基本可满足对美国、加拿大和中国产区樱桃的产地溯源要求。