漆酶催化碘处理竹材防霉性能*

饶 瑾 Nayebare Kakwara Prosper 杨胜祥 吴华平 杨秀树 孙芳利

(1.浙江农林大学工程学院 杭州 311300；2.浙江农林大学理学院 杭州 311300；3.浙江杭化新材料科技有限公司 杭州 311305)

竹子是一种天然速生材料，与木材有着相似的质感。我国竹类资源丰富，养竹历史悠久，竹材作为国家第二大林业产业填补着木材供需矛盾的缺口，同时也为竹产区农民的脱贫致富作出了重要贡献，尤其在我国南方地区，如浙江、江西、福建和湖南等省，竹产业已成为当地经济发展的支柱和主导产业(贺勇等，2009)。然而，竹材因含有较多的糖类、淀粉和蛋白质等营养物质(吴海萍等，2006)，在加工、贮存和使用过程中易发生霉变，不仅影响竹产品的外观，而且空气中大量的霉菌孢子还让人呼吸不畅，甚至造成呼吸道疾病，给企业和消费者带来了一定损失。

众多学者已在低毒、环保和高效的防霉剂研发方面做了大量工作，但在实际使用中仍存在毒性、防霉效果不理想和抗流失性差等问题，尤其是用于食品和人体接触的竹制器具，如竹筷、砧板、竹席和玩具等，防霉剂的流失不仅降低防霉效果，而且还会污染环境、影响人们的健康(赵鹤等，2010)。因此，开发天然无毒且具有一定抗流失性和防霉效果好的防霉剂尤为重要。

随着人们对环境生存质量要求的日益提高以及对环境保护意识的不断加强，有机氯杀虫剂和五氯酚类防霉剂均已停止使用和生产(陈利芳等，2012)，开发绿色环保无污染的防霉剂是今后必然的发展趋势。樟树(Cinnamomuncamphora)叶提取物、壳聚糖和竹醋原液等已被用于竹材防霉(徐国祺，2011；孙芳利等，2006；沈哲红等，2009)，这些以天然提取物为主要成分的防霉剂不仅对环境和人体无毒无害，而且还能有效抑制霉菌对竹材的侵染，然而不断拓展的竹产品种类和应用领域对防霉剂的持效性提出了新要求。碘及其衍生物在医药领域有着广泛应用(王卫平等，2008)，但其缺点是活性成分很容易从材料中流失出来。有研究指出，漆酶作为一种催化氧化剂，可通过自由基反应活化生物质的木素成分(Yaropolovetal.，1994)，已用于无甲醛人造板和木材抗菌中(金春德等，2009；Schubertetal.，2012)

鉴于此，本研究利用漆酶催化氧化特性，使无毒杀菌剂碘与竹材形成稳定化学键提高碘的抗流失性，增强竹材防霉性能，以期为天然无毒防霉剂的开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材 采自浙江省杭州市临安区三口镇4年生新鲜毛竹(Phyllostachysedulis)，取地上2～4 m处，剖开后去青去黄，加工成 50 mm×20 mm×5 mm(长 × 宽 × 厚)，称质量，记作m1，然后用游标卡尺测其长度、宽度和厚度，计算体积V。

1.1.2 菌种 木霉(Trichodermaviride)、桔青霉(Penicilliumcitrinum)和黑曲霉(Aspergillusniger)。

1.1.3 药剂 磷酸二氢钾(KH2PO4，AR，湖州湖试化学试剂有限公司)；碘化钾(KI，AR，杭州萧山化学试剂厂)；2，2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS，上海阿拉丁试剂有限公司)；活性为0.50 U·mg-1的漆酶(Laccase，Sigma-Aldrich公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 试样处理 1) 药剂配制 将6.804 5 g KH2PO4溶解到1 L 容量瓶中，加蒸馏水定容，配成磷酸盐缓冲液(PBS)，各处理液均以PBS缓冲液为溶剂。采用精度0.000 1 g的电子天平精确称取漆酶，在1 000 mL容量瓶中配制1.5×10-3、3.3×10-3和4.8×10-3wt.‰的漆酶溶液，并分别与0.15 mol·L-1KI和1.46 mol·L-1ABTS混合组成3组处理液，另取碘化钾制成0.15 mol·L-1KI缓冲溶液。

2) 试样浸渍处理 将竹块置于1 000 mL烧杯中井字形摆放，用惰性重物压住竹块以防止其浮动，加入上述配制好的溶液。为了保证漆酶活性，所有处理组均放入40 ℃水浴锅内恒温24 h，充分反应。反应结束后取出竹块，称质量得m2，将竹块风干12 h后放入鼓风干燥箱，40 ℃干燥3 h。

1.2.2 防霉试验 1) 不同菌种防霉测试 防霉试验的试样准备、处理和接种等均参照《防霉剂对木材霉菌及变色菌防治效力的试验方法》(GB/T 18261—2013)的相关规定进行。未经任何处理的竹块作为对照组(Control)，0.15 mol·L-1KI缓冲溶液处理组(KI)以及由0.15 mol·L-1KI缓冲溶液、1.46 mol·L-1ABTS和浓度分别为1.5×10-3、3.3×10-3或4.8×10-3wt.‰漆酶缓冲溶液组成的处理组分别记作1.5LI、3.3LI和4.8LI。所有竹块分别进行木霉、黑曲霉和桔青霉接菌试验，接菌后的竹块置于温度28±2 ℃、相对湿度85%±5%的培养箱中培养4周。竹块接菌培养第2天起，目测试菌感染面积和霉菌生长情况，主要检查试样表面感菌程度。被害值按表1分级(被害值越低，防霉效果越好)，根据试样被害值评定防霉剂的防霉效果和防治效力(resisting efficacy，RE)。防霉剂对3种霉菌的防治效力按下式计算：RE=(1-DtDo)× 100%，其中:RE为防治效力；Dt为药剂处理试样的平均被害值；Do为对照试样的平均被害值。

表1 试件霉变的分级标准Tab.1 Classes of the infection value of the tested bamboo blocks

2) 综合防霉试验 为研究漆酶催化碘处理材流失前后的防霉性能，取未流失对照组(UL-control)、0.15 mol·L-1KI缓冲溶液处理组(UL-KI)以及由0.15 mol·L-1KI、1.46 mol·L-1ABTS 和浓度4.8×10-3wt.‰漆酶缓冲溶液混合成的处理组(UL-4.8LI)，将竹块钻孔悬挂于如图1所示可调控温湿度的防霉试验箱中，按照美国木材保护协会标准AWPA E 24-12进行防霉试验，防霉试验箱中放置由木霉、黑曲霉和桔青霉混合感染的竹块和土壤，温度保持(28±2) ℃、相对湿度85%±5%，每周检查霉变面积，按照表1记录霉变程度。另取对照组、0.15 mol·L-1KI缓冲溶液处理组以及由0.15 mol·L-1KI、1.46 mol·L-1ABTS和浓度为4.8×10-3wt.‰漆酶缓冲溶液混合成的处理组，先进行流失试验，然后按照上述方法进行防霉性能测试。流失竹块编号依次分别为L-control、L-KI和 L-4.8LI。

流失试验按如下步骤进行，将竹块按照每块加入50 mL蒸馏水进行浸泡，连续浸泡14天，每天相同时间更换新鲜蒸馏水，收集流失液，用电感耦合等离子体质谱仪(NexlON 300D，美国PerkinElme)检测流失液中碘含量。

图1 综合防霉试验箱Fig.1 Comprehensive anti-mildew test chamber

1.2.3 竹材中碘固着率测试 参考《木材防腐剂对腐朽菌毒性实验室试验方法》(LY/T 1283—2011)，先计算竹块中碘的载药量R(kg·m-3)，再根据流失液中碘含量计算碘的流失量L(kg·m-3)。根据下式计算碘固着率F(%)：

式中：m1为防霉液处理前竹块质量(g)；m2为防霉液处理后竹块质量(g)；CI为处理液中碘的质量百分数(wt.%)；V为防霉液处理前竹块体积(cm3)；mL为流失液中碘含量(g)。

1.2.4 化学组分表征 为进一步研究漆酶碘化处理对竹材化学组成和结构的影响，探索漆酶碘化处理防霉机制，选取流失试验后对照组L-control和混合液处理组L-4.8LI的竹块进行FTIR和XPS测试。

将竹块粉碎后取小于100目的竹粉，与溴化钾混合研磨并压片，采用傅里叶变换红外光谱仪(IRPrestige-21，日本岛津)进行红外光谱分析。样品扫描范围为4 000～400 cm-1，扫描分辨率为4 cm-1。采用X射线光电子能谱仪(Thermo Fisher Scientific，USA)对竹粉进行XPS分析，打开氩离子枪原位刻蚀样品30 s，以排除试样表面存在杂质的影响。样品以单色化 A1 Kα射线(1 486.6 eV)激发，在真空度小于 5×10-7Pa的分析室中对试样进行扫描，扫描范围为0～1 100 eV。

2 结果与分析

2.1 不同浓度漆酶催化碘处理竹材的防霉效果

碘及其化合物是一种毒性较小的杀菌剂，常用于医药卫生领域，将其用于霉菌的抑制尚未见报道。为了得到漆酶对不同竹材霉菌的抑制作用，本研究采用木霉、黑曲霉和桔青霉分别接种试块，研究3种霉菌对竹材的感染情况。

2.1.1 防木霉效果 木霉是竹材常见的污染性霉菌，尤其是绿色木霉，受该种霉菌感染的竹材表面呈绿色或灰绿色，感染速度快，在温暖潮湿的环境中，不到10天就能覆盖整个竹材表面。图2a为不同处理材在室内试验中受绿色木霉感染平均被害值，可以看出，0.15 mol·L-1KI缓冲溶液处理竹块接种绿色木霉28天后，竹块平均被害值达到1.72。采用漆酶催化碘处理竹块，绿色木霉感染程度降低，防霉效果明显增加。浓度为3.3×10-3和4.8×10-3wt.‰漆酶催化碘处理竹块防木霉效果最佳，平均被害值分别为0.12和0.10，几乎不发霉。

2.1.2 防黑曲霉效果 黑曲霉感染能力最强，繁殖最快，其分生孢子呈黑色，竹材感染该霉菌后，表面呈黑色斑点，有时连成片。未处理竹块第5天就已全部覆盖菌丝(图2b)，0.15 mol·L-1KI缓冲溶液处理竹块第6天开始感染霉菌，第7天已有一半以上的竹表面覆盖菌丝，平均被害值达到2.5，随后被害值不断增加，第21天长满菌丝。漆酶催化碘处理竹块对黑曲霉的抑制效果优于碘化钾处理竹块，可延缓黑曲霉的生长和繁殖。浓度为1.5×10-3wt.‰漆酶催化碘处理的竹块防黑曲霉效果不如浓度为3.3×10-3wt.‰和4.8×10-3wt.‰漆酶催化碘处理的竹块。但在16天后黑曲霉增长较快，所有竹块21天时几乎全部被黑曲霉菌丝覆盖。

2.1.3 防桔青霉效果 桔青霉对竹块的侵染较慢，对照组和0.15 mol·L-1KI缓冲溶液处理组在第7天时开始感染桔青霉，随后菌丝繁殖较快，第12天时2种处理组竹块表面几乎布满菌丝(图2c)。桔青霉在漆酶催化碘处理的竹块上生长和繁殖较缓慢，第10天开始出现菌丝，10～14天生长缓慢，14天以后开始迅速生长，并在24天时竹块几乎完全被菌丝覆盖。相比较来看，浓度为3.3×10-3wt.‰漆酶催化碘处理竹块防治效果最佳。与黑曲霉效果相似，所有竹块21天后几乎长满菌丝。

图2 不同浓度漆酶对木霉(a)、黑曲霉(b)和桔青霉(c)的防霉效果Fig.2 Anti mold efficiency of different activity of laccase against T.viride (a),A.niger (b),P.citrinum (c)

为了进一步评价几种处理对3种霉菌的防治效果，根据处理材受3种霉菌侵染后各自的平均被害值，计算各处理材对3种霉菌的防治效力，结果如表2所示。0.15 mol·L-1KI缓冲溶液处理组对3种霉菌的综合防治效力在7天左右就降到59.52%，14天后只有29.31%，随后变化不大，这说明碘化钾单独处理竹材也具有一定防霉效果，但效果不理想。漆酶催化碘处理竹材对3种霉菌的防治效力都有显著提高，前14天3.3LI和4.8LI的综合防治效力都能达到80%以上，14天后防治效力开始明显下降，28天试验结束后，漆酶催化碘处理的竹块防治效力仍能达到30%以上。

表2 不同处理对3种霉菌的防治效力
Tab.2 Resisting efficacy of different activitylaccase toT.viride,A.nigerandP.citrinum

时间Time/d防治效力Resistingefficacy(%)KI1.5LI3.3LI4.8LI759.5299.86100.00100.001429.3167.9294.8681.942120.0834.5837.5036.782819.7231.9434.7235.28

2.2 处理材的抗流失性能

在实际使用时，竹产品往往会受到水的淋洗，如砧板、筷子和竹席等生活用品。为了更进一步了解实际使用时的情况，将未流失和流失后的竹块置于木霉、青霉和黑曲霉混合菌感染的防霉试验箱中，进行为期3个月的防霉性能测试，结果如图3所示。对照组第7天就完全霉变。碘化钾单独处理的竹材未经流失试验(UL-KI)21天前有一定防霉效果，但霉菌生长和繁殖较快，65天后失去防霉效果，其防霉效果明显低于漆酶催化碘处理的UL-4.8LI组。UL-4.8LI组虽然随着时间延长被害值呈上升趋势，但91天后被害值仍处于3左右。经过14天流失试验，碘化钾处理材(L-KI)前7天防霉效果与流失前相当，7天后防霉效果远低于流失前的防霉效果，说明有一部分碘从竹块中流失出来，从而降低了其防霉效果。与未流失试材UL-4.8LI相比，流失试材L-4.8LI防霉效果虽有所下降，但明显比L-KI组好。以上结果表明，漆酶催化碘处理竹材能有效提高竹材防霉效果，且具有一定的抗流失性。

图3 不同处理方式流失前和流失后的防霉效果Fig.3 Anti mold efficiency of different treatments before and after leaching

从以上分析可以看出，碘化钾虽能在一定程度上提高竹材的防霉性，但是流失后防霉性能明显降低。而漆酶催化碘处理竹材不仅可提高竹材的防霉性，而且具有一定的抗流失性。碘固着率计算结果如表3所示。碘化钾处理组和浓度为4.8×10-3wt.‰漆酶催化碘处理组流失试验前碘载药量分别为0.81和0.79 kg·m-3，说明2种处理方法碘的吸药量差别不大。但经过流失试验后，碘化钾处理组碘固着率只有37.47%，漆酶催化碘处理组碘固着率高达86.13%，远远高于碘化钾处理组。这一结果说明漆酶能通过某种反应将一部分碘固定在竹材中，提高了碘的抗流失性。

表3 竹块碘固着率Tab.3 Fixation of iodine in bamboo blocks

2.3 处理竹材的红外光谱分析

为了更好了解漆酶催化氧化碘处理后竹材发生的化学变化，对改性前后的竹材进行FTIR分析，结果如图4所示。1 600和1 510 cm-1处表征木质素苯环结构的吸收峰强度减弱，表明木质素发生了变化，推测漆酶催化氧化碘化钾主要发生在木质素上，导致木质素中C—C键和苯环裂解(Bourbonnaisetal.，1995)，与Schubert(2012)的研究结果相似，在无胶纤维板研究中也发现漆酶对木质素有作用(金春德等，2009)。1 087和882 cm-1处峰的增强可能与苯环上形成的C—I键有关(Coates，2000)。2 971 cm-1和2 921 cm-1分别代表—CH3和—CH2—，处理材这2处峰明显增强，可能是木质素侧链的C—H键发生了变化。

2.4 处理前后竹材表面的XPS分析

2.4.1 竹材表面化学组成分析 X射线光电子能谱能够用于分析竹材处理前后表面化学成分及元素状态的变化，有助于推测漆酶催化碘处理竹材的反应机制。图5为竹材改性前后的XPS能谱，不管是对照材还是处理材都存在C1s、N1s和O1s 3个峰，分别表示C、N、O元素。从图5可以看出，处理材明显多了一个I3d峰(Qingetal.，2015)，表4中对照材I含量为0，处理材则为0.17%，说明处理后的竹材经过14天浸泡仍存在I元素，这部分碘可能与竹材发生了反应。618.7和630.2 eV为KI的特征峰，说明有少量KI留存于竹材中未被淋洗出来。621.0和632.6 eV为C—I键的特征峰(Wangetal.，2004)，远大于KI的特征峰。C—I键的形成可能与木质素有关，这一点在上述红外分析中也已证明。据报道，漆酶能够氧化木质素产生苯自由基或苯氧自由基(Sjöström，1993)，同时也能氧化KI产生碘自由基(Xu，1996)，二者可以反应形成C—I共价键，提高碘的固着率，从而赋予竹材一定的抗菌性(Ihssenetal.，2014；Schubertetal.，2012)。值得关注的是，漆酶氧化竹材后O/C应该增加，但试验得出的结果却减小，这可能与C—I键的形成机制有关。

图4 改性前后竹材的红外光谱分析Fig.4 FTIR spectra of bamboo powder before and after modification

图5 竹材表面XPS能谱Fig.5 XPS spectra of bamboo

表4 对照材和改性材的O/C和I/CTab.4 O/C ratio and I/C ratio of control and modified bamboo

图6 竹材表面的C1s XPS图谱Fig.6 C1s XPS spectra of bamboo

2.4.2 竹材表面C1s分析 Dorris等(1978)将木材中的碳原子划分为4种结合形式，据此可对C1s谱通过曲线拟合出4个峰，分别为C1、C2、C3、C4。由于O1s峰在木材表面化学组成研究中的重要性远不如C1s峰(杜官本，1999)，且关于不同化学态O元素结合能的数据较少并存在争议(Inartetal.，2006)，因此本研究未对O1s进行分峰拟合处理。

图6和表5分别为竹材表面的C1s XPS图谱和不同化学态C的百分比。无论是对照材还是处理材，C2所占百分比都是最高的，分别为61.79%和53.31%，这是由于C2是纤维素和半纤维素C的主要结合方式(丁涛等，2017)。处理材中代表木质素含量的C1面积百分比明显增加，代表纤维素和半纤维素含量的C2面积相对减少，C1/C2从0.47增加到0.69，说明纤维素和半纤维素氧化较多，而木质素的变化有2种可能性：一是氧化程度低，由于漆酶对木质素的氧化性已得到认可，故其可能性较小；二是木质素氧化后形成含氧自由基，含氧自由基被碘自由基取代形成C—I键。木质素苯环结构的变化和C—I键的形成在红外分析和I3d XPS图谱上得到证明。

表5 对照材和改性材不同化学态C的百分比Tab.5 Distribution of different C components of control and modified bamboo

3 讨论

竹材中丰富的糖类、淀粉和蛋白质使其极易受到霉菌侵染而产生霉变(孙芳利等，2006)，现如今市场上所用防霉剂大多对环境和人畜有害，因此研发安全环保的防霉方式具有重要的科学价值和广阔的市场应用前景。此外，当竹材作为筷子和砧板等频繁水洗领域使用时，需要处理材防霉剂抗流失，防霉效果持久。本研究利用漆酶能够同时氧化碘化物和芳香族的特性(Witayakranetal.，2010)，在碘化钾溶液中加入漆酶共同处理竹材，通过防霉和流失试验，检测试块的防霉和抗流失性能，并采用FTIR和XPS分析试块主要化学键和元素的变化，以此探究漆酶催化碘处理竹材的反应机制。

木霉、桔青霉和黑曲霉是引起竹材霉变常见的3种霉菌，本研究利用这3种霉菌对试块侵染后发现，漆酶催化碘处理组防霉效果均明显高于碘化钾单独处理组。碘化钾单独处理组和浓度为4.8×10-3wt.‰漆酶催化碘处理组虽然具有相似的碘载药量，但是经过14天去离子水流失试验后，碘化钾单独处理组碘固着率远远小于漆酶催化碘处理组。而混合菌防霉试验也表明即使经过流失处理，漆酶催化碘处理组防霉效果仍高于碘化钾单独处理组。这说明漆酶催化作用将碘固着在竹材内部，不仅提高了竹材的防霉性能，同时也增强了碘化物的抗流失性能。

已有研究表明，漆酶既能氧化碘化钾又能作用于酚类化合物，如竹材中的木质素。本研究借助漆酶这一特性使碘与竹材中的木质素发生反应，防霉试验和流失试验证明漆酶催化碘化钾后能将碘固着于竹材中。为了进一步探索其固着机制，采用红外光谱和X-射线光电子能谱进一步分析测试。红外测试发现，漆酶催化碘处理主要使竹材中的木质素发生较大变化，其反应机制可能是木质素被漆酶氧化形成含氧基团并产生自由基，碘化钾则被氧化成碘自由基，二者可能形成C—I键。X-射线光电子能谱证实了C—I键的存在。这一研究结果揭示了漆酶催化碘化物处理竹材后防霉性能和抗流失性提高的原因，为漆酶催化氧化在木竹材保护和改性中的应用提供了新思路。

4 结论

碘化钾单独处理竹材在试验初始阶段有一定防霉效果，但后期竹块发霉严重，说明防霉效果不持久。漆酶催化碘处理竹材能有效提高竹材防霉效果，尤其对木霉有较好的防霉作用，且漆酶浓度越大，防治效力越高。加入漆酶催化碘化物作为竹材防霉剂还能有效解决碘易流失的问题，提高碘的固着性和防霉性能，扩大碘及其衍生物在木竹材防霉防腐方面的应用。