人源猪链球菌19 株分离鉴定及毒力基因检测

易雪丽， 袁朝原， 陈晓颖， 邓 鹰， 谭 昙， 滕元姬， 罗 斌

猪链球菌病为人畜共患病，可通过猪传人途径传播。猪链球菌根据其荚膜多糖抗原分为35个血清型，其中2型致病性最强，是人感染猪链球菌病的最主要病原[1]。人感染猪链球菌一般以散发病例多见，在我国多个省市均有散发病例报道[2-3]，但也曾有过罕见的大流行；1998年在江苏江阴、2005年在四川资阳分别出现了2次2型猪链球菌病大流行，且表现出了罕见的“链球菌中毒性休克综合征”，发病急骤，来势凶险，病死率高[4]。2016年在广西也有人感染猪链球菌疫情报道，共引起6例发病，1例死亡[5]。

猪链球菌的致病力主要取决于其毒力因子，对猪链球菌毒力因子的研究主要集中于单个毒力因子的致病性方面，目前已经发现多种猪链球菌毒力因子，包括荚膜多糖（cps2J）、溶菌酶释放相关蛋白（mrp）、细胞外蛋白因子（ef）、纤粘连蛋白结合蛋白（fbps）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapdh）和毒力相关基因orf2等[6-8]。其中cps2J为主要毒力基因，同时也是猪链球菌2型的型特异性基因，可以作为鉴定猪链球菌2型的靶基因。目前上海、广东和四川等地都有致病性猪链球菌毒力因子检测相关报道[9-11]，百色地区尚未有相关报道。为了解本地区猪链球菌对常用抗生素的耐药及其分子流行病学特征，本课题收集了右江民族医学院附属医院2015－2019年临床分离的猪链球菌，检测其对常用抗生素敏感性及其毒力基因携带情况，为本地区人感染猪链球菌病防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株来源 收集我院2015－2019年从猪链球菌脑膜炎患者标本中分离的猪链球菌19株。其中分离自血液4株，分离自脑脊液15株。所有菌株分离培养按照《全国临床检验操作规程》第3版进行[12]，分离菌株于-80 ℃冰箱中保存。

1.1.2 主要仪器与试剂 VITEK MS V3.0（法国生物梅里埃公司）；PCR仪（美国BioRad公司）；电泳及凝胶成像设备（美国BioRad公司）；哥伦比亚血琼脂平皿购自郑州安图生物公司；纯乙腈购自法国生物梅里埃公司；标准菌株大肠埃希菌（ATCC 8739）由法国生物梅里埃公司提供；DL-96 STREP购自珠海迪尔生物工程有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；PCR SuperMix购自Invitrogen公司；DNA Marker DL 2000购自宝生物工程（大连）有限公 司。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定 使用VITEK MS V3.0实施基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对菌株进行鉴定。将菌株接种于哥伦比亚血琼脂平皿，放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养18 h。用一次性接种环挑取适量细菌均匀涂布于VITEK MS靶板上，随后加1 μL基质溶液于样品上，自然晾干。同时以ATCC 8739作为质控菌株，采用VITEK MS IVD模式进行样品数据采集和鉴定分析。

1.2.2 药物敏感性试验 按照CLSI推荐的微量肉汤稀释法测定猪链球菌对8种常用抗生素的敏感性，包括青霉素、氨苄西林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、万古霉素、红霉素、克林霉素，结果判读参照CLSI M100 2019年版中草绿色链球菌判断标 准。

1.2.3 毒力基因检测 按照说明书使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取猪链球菌基因组DNA作为模板，参照文献 [13]合成特异性引物对猪链球菌的16S rDNA、cps2J、mrp、ef、orf2、fbps、gapdh进行扩增，引物相关序列及退火温度见表1。采用50 μL的反应体系进行PCR扩增，扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min。取7号标本扩增产物送至广州艾基生物有限公司测序，测序结果在GenBank中经BLAST比对分析，确定为目的基因后作为阳性对照。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪成像后与阳性对照进行比对，所出现条带与阳性对照大小相同者为阳性结果。

2 结果

2.1 细菌鉴定

19株菌株经VITEK MS鉴定均为猪链球菌，鉴定正确率99%以上。

2.2 药物敏感性试验

19株猪链球菌对氨苄西林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松和万古霉素100%敏感，对青霉素的敏感率为68.5%，对红霉素、克林霉素100%耐药。药敏结果见表2。

2.3 毒力基因检测

利用合成的特异性引物对提取的猪链球菌基因组DNA进行扩增后，7号标本在预期位置均出现条带，见图1。送扩增产物进行测序，结果显示与GenBank中登记的目的基因100%同源，以7号标本作为阳性对照。根据猪链球菌16S rDNA种特异性基因和6种常见毒力基因检测结果显示，19株均为猪链球菌，cps2J型特异性基因检测结果显示19株菌株中有16株均为猪链球菌2型。19株中有12株携带6个常见毒力基因，4株携带5个常见毒力基因，2株携带4个常见毒力基因，1株携带3个常见毒力基因。所有菌株均携带了ef与fbps这2个毒力基因。各样本毒力基因扩增结果见表3。

表1 猪链球菌基因检测引物及其产物大小Table 1 Primers used to detect genes in Streptococcus suis and expected product sizes

表2 19 株猪链球菌对常用抗生素的药敏结果Table 2 Susceptibility of 19 strains of Streptococcus suis to common antibiotics（%）

图1 毒力基因检测扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳Figure 1 Electrophoretic analysis of virulence genes in 1% agarose gel after PCR amplification

表3 猪链球菌毒力基因检测结果Table 3 Results of virulence gene detection in Streptococcus suis

3 讨论

人感染猪链球菌主要是接触了感染猪链球菌的病猪、死猪，病原菌经破损的皮肤和黏膜进入体内致使人感染猪链球菌，从事生猪屠宰的人员为猪链球菌病高发人群。猪链球菌感染人后以引起脑膜炎为主，患者大多有不同程度发热，部分病例有意识障碍、脑膜刺激症及休克等表现。该病起病急，病程凶险，病死率高且预后不良，部分病例有不同程度的听力损害。根据临床症状不同，将人感染猪链球菌分为普通型、脑膜炎型、休克型和混合型。桑福德抗微生物治疗指南对于猪链球菌感染推荐治疗方案为首选青霉素，次选万古霉素或头孢曲松；休克型患者常选用青霉素类和氨基糖苷类或喹诺酮类联合抗感染以及人工呼吸机支持呼吸、中心静脉压监测、积极扩容等；脑膜炎型患者更需在抗感染的同时积极降颅压，给予激素以减轻粘连等治疗[2]。

本课题采用了MALDI-TOF MS技术对19株分离株进行了鉴定，鉴定结果显示该技术可以准确地鉴定出猪链球菌[14]。MALDI-TOF MS技术对微生物鉴定的理论基础是将设备采集的未知样品蛋白指纹图谱与数据库中已知菌种的图谱进行统计学聚类分析，获得鉴定结果[14]。该技术在细菌和酵母的鉴定方面已经很成熟，同时因为该技术快速准确，操作简便且成本低，所以近年来在全国得到快速普及。随着MALDI-TOF MS临床应用的普及，大大缩短了临床病原微生物的鉴定报告时间，为临床治疗争取了宝贵时间。19株猪链球菌的药敏检测结果显示，所有分离株对氨苄西林、头孢吡肟、头孢曲松、头孢噻肟和万古霉素敏感率为100%，但是对青霉素的敏感率有所降低，特别应注意的是对红霉素和克林霉素100%耐药。畜牧业一直极为关注猪链球菌对常用抗生素的耐药性。蔡田等[15]研究结果显示，猪链球菌对大环内酯类抗生素耐药率高达98.1%，大部分携带ermB耐药基因。胡军勇等[16]研究结果同样显示猪链球菌对林可酰胺类、大环内酯类、硝基呋喃类药物的耐药率均在90%以上。本研究结果与之相符，猪链球菌病为人畜共患病，人源分离猪链球菌对红霉素及克林霉素的高耐药性考虑源自于病猪。猪链球菌的致病力主要取决于其所携带的毒力因子，有研究结果显示，携带mrp和ef是猪链球菌高致病性的标志，本次毒力基因检测显示mrp携带率为84.2%，ef携带率为100%，这一结果与我国其他地区的报道相一致[11，17]。此外，fbps携带率为100%，要远高于李小军[9]的报道。因此，本地区流行的猪链球菌主要以cps2J、mrp、ef、orf2、fbps、gapdh型为主。

随着现代养殖业的迅速发展，猪链球菌病的发生趋势也呈明显上升。因此及时掌握本地区致病性猪链球菌对常用抗生素的耐药性及其毒力因子的流行病学，对于预防和控制大规模暴发猪链球菌病具有重要的意义。