巴马小型猪心脏移植模型及供心保护策略*

李斯林, 孙煦勇△, 秦科, 李海滨, 莫安胜, 侯善升, 莫仁才, 刘军, 黎艳培, 黄燕嫣

1广西医科大学第二附属医院器官移植科(广西南宁 530007)； 2中国人民解放军联勤保障部队第九二三医院移植医学研究院(广西南宁 530022)； 3广西中医药大学第一附属医院心胸血管外科(广西南宁 530023)

在20世纪中期，南非外科医生成功开展了人类历史上的首例心脏移植手术[1]，伴随着供体心脏保存及心脏外科技术的不断进步，心脏移植术后患者的生存率在逐年提高[2]，使心脏移植成为目前常规治疗措施无法治愈的终末期心脏疾病的有效治疗方式[3]。我中心为将心脏移植实验平稳过渡至临床应用，于2017年8—11月建立11例巴马小型猪的心脏移植模型，以提高手术操作技能和增加围手术期处理及供心保护经验，具体如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物采用健康广西巴马小型猪作为供、受体各11头，供受体同窝雌雄不分，体重25～35 kg，供体及受体体重相近或供体体重略重于受体体重。

1.2 手术方法

1.2.1 术前准备 供受猪术前禁食6～8 h，禁饮4 h，常规进行胸部及大腿外侧配皮以粘贴心电监护仪电极片及手术电刀电极板。

1.2.2 供心获取 供猪进行麻醉及气管插管成功后，常规进行心电监护及股动脉压检测，取胸正中切口，电锯平整锯开胸骨，静脉注射肝素2 mg/kg，切除胸腺组织，剥离心包与胸膜间的脂肪组织，心包外依次游离上腔静脉、左齐静脉、下腔静脉并挂套7号丝线备用。剪开心包，充分暴露心脏、升主动脉及肺动脉主干。于主动脉根部进行荷包缝合完毕后插入主动脉灌注针头并排气固定。

用丝线将左齐静脉在进入冠状静脉窦处结扎，后靠远端结扎上腔静脉，钳闭下腔静脉，在心脏继续搏动数下排出肺循环血液后于无名动脉起始处阻断升主动脉，同时开始灌注4℃ St.Thomas液约1 000 mL，快速靠远端剪开下腔静脉及右心耳减压引流，观察灌注及回流情况，于心脏表面覆盖软冰降温。灌注完毕后，将手术切口迅速延长至颈部，分离出气管并离断消毒。打开两侧胸膜，切断下肺韧带，将气管向上提起，沿着气管背侧迅速向下游离，于降主动脉处切断主动脉，保留完整的主动脉弓结构及完好的食管。心肺离体后继续予4℃ UW液1 000 mL灌注冠脉系统。在灌注过程中游离上下腔腔静脉及奇静脉，沿气管前侧逐渐游离左心房及肺动脉组织，心肺分离。适当修剪主肺动脉、主动脉弓及部分降主动脉，切除多余的心包组织。标记上下腔静脉内外侧及左肺静脉开口处。经检查无意外损伤后将供心置于4℃ UW液中保存备用。

1.2.3 供心植入 受猪麻醉满意后切开暴露颈内动静脉并分别置管以持续监测动脉压及中心静脉压，予膀胱造瘘监测术中尿量情况。

取胸正中切口，开胸后静脉注射肝素2 mg/kg，切除胸腺组织，剥离心包与胸膜间的脂肪组织，常规建立体外循环。阻断上、下腔静脉及奇静脉，沿着左心耳顺着房室交界沟向下及向上完整切除供心，尽量保留上下腔、主动脉、肺动脉全段及部分心肌组织，适当分开上、下腔静脉相连的右房组织，若伤及右肺静脉则予以修补。将供心适当修剪后，最初5头心脏移植采用传统单线连续缝合方式依次进行左心房、下腔静脉、主肺动脉、升主动脉及上腔静脉的吻合。后6头心脏移植于左上肺静脉开口处作为定点，以右下肺静脉开口处作为对点，采用双线连续交叉缝合方法吻合左心房(图1)。同法以左右侧对点的方式采用双线连续交叉缝合方法分别吻合下腔静脉及主肺动脉(图2)。于供猪降主动脉起始部修剪适合长度后与受猪升主动脉以左右侧对点的方式采用双线连续交叉缝合的方法吻合。经鼓肺排气后分别闭合主动脉弓部的两根头臂干分支。减流量后开放主动脉恢复供心血供，待供心恢复自主心跳后于上腔静脉左右侧缘为对点采用双线连续交叉缝合方法吻合上腔静脉。检查并缝合部分吻合口漏。并行1 h后供心跳动良好，血压等生命征平稳即可停机并依次撤除体外循环。

图1 对点双线交叉缝合方法吻合左心房

图2 对点双线交叉缝合方法吻合主肺动脉

1.3 体外循环管理 心脏移植过程中均采用中低温体外循环管理，维持主动脉灌注流量80～120 mL/(kg·min)，控制平均动脉压在50～70 mmHg，密切监测相关指标变化，适当应用血管活性药维持循环稳定。术中注意控制液体入量及胶晶比例，适当超滤以保持内环境稳定、清除炎性产物、减少组织水肿。供体心脏恢复灌注复跳后，保持右心系统充分引流及左房减压，以此减轻右心前后负荷及避免心腔过度充盈，减少心内膜下缺血及降低心肌氧耗，适当增加循环并行时间，待供心功能逐渐恢复后自然过渡至自身循环。

1.4 术后处理 撤除体外循环后常规关胸，密切观察生命征、尿量、引流量等，根据中心静脉压、血压等指标适当补液及使用血管活性药。所有受猪均在手术后2 h处死。

2 结果

2.1 移植心脏成功恢复自主心跳情况 11头受猪中有8头移植心脏成功恢复自主心跳,其中有2头经心内电除颤恢复窦性心律，另有1头受猪开放后即恢复自主心跳，短期内血流动力学稳定，并行过程中出现心肌肿胀、颜色灰暗、收缩功能下降，难以用升压药物维持，经激素冲击治疗后好转。有3头开放后出现室颤未能恢复自主心率。

2.2 术后吻合口出血情况 11头受猪最初5头吻合口有明显活动性出血，后6头出血较少，可顺利关胸。

3 讨论

3.1 手术方式及改进 本实验采用的是健康的广西巴马小型猪，其解剖特点如下[4]:(1)心包与胸膜之间存在比较宽厚的脂肪层,术中容易顿性剥离两者且出血较少。(2)左、右心房壁比较薄弱,容易被撕裂。(3)上、下腔静脉血管壁非常薄弱,同样被脂肪组织覆盖包绕，在心包外延续较长距离。(4)猪心的供血系统及解剖结构与人类心脏类似，但左右冠状动脉的分支有丰富的交通网可形成了房室和室间2个环路。(5)在前降支静脉处有左奇静脉一同汇入冠状窦回流至右心房，组成心脏的静脉回流系统。

因此，我们开胸之后先分离心包外脂肪层、切除胸腺，在心包外将上下腔静脉、左奇静脉、升主动脉进行带备用，此法相对简单及便利，破裂出血风险较小。在建立体外循环时，尽量靠近腔静脉及升主动脉远端进行荷包缝合，本实验组均采用直角管进行插管引流，可减少术中管道通路占用的术区空间，减轻缝合操作难度。猪上下腔及左心房管壁菲薄，容易撕裂漏血，本组最初5头心脏移植采用常规方式进行心房及大血管吻合，均出现明显活动性出血，出血部位多为左心房、上腔及主动脉吻合口；后6头经过改进后在无张力下采用双线对点外翻连续交叉缝合的方式进行吻合可明显减少撕裂漏血现象出现，同时此法可保持内膜光滑，避免管腔狭窄，减少血栓形成风险。猪心冠脉系统交通支丰富，有左奇静脉汇入[5]，因此，在获取供心灌注过程中容易出现左奇静脉血逆灌导致心脏复跳而加重心肌损伤；另外，在移植过程中左奇静脉血的回流可引起术区淤血影响术野及局部升温，并引起心肌提前复跳加重缺血再灌注损伤，经验证明提前分离结扎或阻断左奇静脉可避免此类不良事件发生。

3.2 供体心脏保存 临床上常用的3种心脏保存液主要是HTK液、Celsior液和UW液。HTK液以低钾离子和低钠离子为特点，包含组胺盐及组胺酸作为缓冲系统，可避免冷保存期间心肌细胞的酸中毒。Celsior是以高钠低钾为特征的细胞外液型保存液，有组氨酸构成缓冲系统，辅以甘露醇及乳糖醛等非渗透性大分子增加胶体渗透压，可有效减少灌注及保存过程中出现的心肌水肿。而UW液则为低钠高钾的细胞内液型保存液，内含羟乙基淀粉、乳糖醛、密三糖等物质有效预防组织水肿出现。有研究显示[6]联合应用St.Thomas液和HTK液共同运用于心脏移植可起到良好的心脏保存效果，St.Thomas液的高钾成分可使心脏迅速停搏以减少心肌代谢，而停搏后的心脏采用HTK液缓冲无氧酵解产生的乳酸，减轻心肌细胞的水肿。但据回顾性及荟萃分析研究[7-8]所示，UW液保存离体心脏效果优于HTK液及Celsior液。因此，本实验组为保证供猪心脏保存效果及提高移植成功率，全部采用ST.Thomas液进行供体心脏的灌停，待心肺离体后采用UW液再次进行灌注及保存。实验结果显示此方式保存效果良好。

相对于单纯低温浸泡保存方式，各种灌注保存方式可有明显的优势[9-14]，因其在保存过程中保持持续的灌注可以冲洗心肌无氧代谢产生的有害物质及相关代谢产物而减少其堆积造成的细胞损伤，可不同程度的避免缺血再灌注损伤、冷缺血损伤并进行移植前器官功能的再评估。以TransMedias公司的含氧温血灌注系统为例，不停跳常温灌注保存的供体心脏移植后30 d的存活率可达100%[15]。国内对离体猪心建立不停跳模型的研究亦显示出心脏灌注保存的意义及价值[16]。本实验组因条件所限，未能进行心脏灌注保存相关的研究，但可作为实验组以后的研究方向之一。

3.3 围手术期处理 心脏移植术后排斥反应是影响受者预后的主要原因之一，对排斥反应的早期发现及处理是提高移植术后生存率的关键[17]。目前心内膜活检被认为是诊断心脏移植术后排斥反应的“金标准”，但因其为有创性操作且增加三尖瓣返流及术后患者病死率而不易被广泛接受[18]，难以成为心脏移植术后排斥反应的常规普查手段。心脏移植术后严重的排斥反应会出现以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，使心肌细胞及其间质水肿、细胞变性、局部纤维化、室壁增厚等综合因素导致左室顺应性及收缩功能下降而可被超声心动图检查监测到[19-20]，其主要表现为心功能下降、室壁增厚及运动异常等。因此，我们认为在心脏移植术后或可采用超声心动图对严重排斥反应进行监测。本实验组为减少排斥反应的发生，采取选用同窝的两头广西巴马小型猪分别作为供受者，手术过程中常规辅以大剂量激素冲击作为免疫诱导及抗排斥治疗。在实验中仅一组出现严重的排斥反应，主要表现为主动脉开放后自主心跳顺利恢复，但在体外循环并行期间突然出现心脏表面颜色变暗、心肌收缩乏力及严重心律失常，在加用大剂量激素二次冲击后，心脏颜色迅速恢复，心肌收缩力逐渐增强，心律失常得以恢复，最终脱离体外循环恢复自主循环。目前的实验条件尚无法对猪的血型及MHC主要抗原进行配对分析，但采用供猪的淋巴细胞与受猪的血清进行淋巴毒实验或可减少或避免此类事件的发生。

3.4 心肌保护 在完成心脏移植过程中，供体心脏的损伤时期主要包括获取时的低灌注及手术损伤、离体保存阶段的冷缺血损伤、移植手术过程中温缺血的影响及开放后恢复冠脉血供造成的缺血再灌注损伤。在器官获取的过程中，血流动力学的波动可引起主动脉灌注前的主动脉低灌注，在心脏灌停后心脏及冠脉的侧支循环可引起心肌局部再灌注甚至复跳，多种因素综合引起心肌的热缺血损伤。在心脏离体后常用的低温保存可诱发心肌细胞水肿，引起大量的乳酸及氢离子堆积导致细胞酸中毒，进而引起细胞质和线粒体钙离子超载及氧自由基损伤进一步加重心肌损伤[21]。在心脏移植手术过程中，供体心脏离开低温保存环境在受体胸腔内进行手术的过程中，温度逐渐升高，心肌细胞代谢加快造成温缺血损伤。在主动脉开放后供体心脏冠脉恢复血供进一步引起心肌的缺血再灌注损伤。因此，在供体心脏获取实验中，本实验组常规对供猪进行全身麻醉、建立心电及血压动态监测，适当补液维持循环稳定以减少血流动力学波动造成冠脉低灌注；在获取过程中，提前结扎奇静脉以减少灌注过程中侧支循环造成的心肌再灌注，灌停时保持心脏自然位，充分保证冠脉的有效灌注及流出道通畅，避免灌注压力过高造成心肌水肿及灌注伤，同时心脏表面予局部冰屑覆盖迅速降温以缩短热缺血时间。

综上所述，巴马小型猪胸腔解剖结构与人类相似，可作为大动物心脏移植模型的理想对象。随着经验的不断积累及技术的不断改进，手术并发症显著减少，同时合理化的心脏保存方式及严密的心肌保护措施可保证心脏移植的顺利进行，而积极防治排斥反应可减少相关并发症出现。本实验组因条件所限，仍有诸多研究尚未开展，现有经验体会可为过渡临床实践提供帮助及为其他研究者开展大动物心脏移植实验提供借鉴。