水热碳材料在分离分析中的应用研究进展

赵兴云, 张红燕, 牛 欢, 吴仁安*

(1.中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁 大连 116023; 2.中国科学院大学, 北京 100049)

1 水热碳材料简介

水热碳材料(hydrothermal carbon)由于可以由生物质直接转化为碳材料、以水为反应介质、绿色可持续的特点得到了广泛关注。水热碳材料是在密闭容器中以糖类或含碳有机物为原料,在一定的温度(130～250 ℃)和自产生的压力下,经过一系列复杂化学反应而转化成的胶状碳材料。早在1913年,Bergius等[1]为了研究煤的形成机理,首次利用水热法处理纤维素得到了黑色的残渣,水热碳材料开始被关注。至21世纪,Wang等[2]首次利用蔗糖为碳源,一步水热法制备出粒径均匀的碳微球,该微球表面具有大量的纳米空隙和比表面,可作为金属锂的载体。随后许多碳水化合物原料被用于水热碳的合成中,比如葡萄糖[3]、果糖[4]、蔗糖[5]、环糊精[6]、甲基纤维素[7]、淀粉[8,9]、木质素[10]、酚类化合物[11]等。随着研究的进一步深入,许多原始生物质材料,如果皮[12]、树叶[13]、贝壳[14]、虾皮[15,16]等也被用于水热碳材料的制备过程中。所合成的碳材料表面含有丰富的羟基、羧基、羰基等官能团,因此具有较好的亲水性,这些官能团提供了丰富的修饰位点,可通过原位反应修饰或合成后修饰的方法对其进行表面改性。原位反应修饰通过在反应液中加入羟乙基磺酸[17]、丙烯酸[18]、卵清蛋白[19]、氨水[20]、葡糖胺[21]、硫酸铵[22]等添加剂,直接引入磺酸基、羧酸基或含氮基团;合成后修饰通过胺[23]、半胱氨酸[24]、4-氨基苯甲酰胺[25]、尿素[26]等与合成的碳球通过表面化学反应而修饰。

图1 葡萄糖衍生水热碳球的生长模型机理图[3]

1.1 水热碳材料形成机理

目前研究[27-29]认为,水热碳微球具有由高芳香内核和亲水表面组成的核-壳化学结构,其表面含有多种反应性的含氧基团(羧基、羰基、酯基、羟基等)。因此,与其他方法制备的碳材料的惰性表面相比,水热碳材料更易改性。生物质水热碳分解的中间产物为各种糠醛类化合物,由于该过程复杂,难以检测,研究人员对其形成机理进行了大量的研究。目前,已有研究基于傅里叶变换红外、X射线光电子能谱、拉曼光谱、核磁共振波谱等表征,认为碳球的生长和形成符合LaMer模型的晶核生长理论,其形成过程主要可分为两个阶段:初期的成核过程和后期的生长过程。如Sun等[27]制备葡萄糖水热碳球时发现微球的直径受反应时间、温度、初始浓度的影响,其中反应时间影响最大,浓度和温度一定时葡萄糖浓度为0.5 mol/L,反应温度为160 ℃,反应时间从2 h增加到10 h,碳微球的直径从200 nm增加到1 500 nm;当葡萄糖浓度为0.5 mol/L、反应温度低于140 ℃或者反应时间小于1 h时,并没有固体颗粒产生。据此认为碳微球的形成机理符合LaMer模型,当葡萄糖水溶液达到临界过饱和点便发生骤然成核现象,后续经过脱水和交联聚合反应,溶液中的化合物会向颗粒聚集并在其表面均匀生长,形成水热碳球,其过程见图1。随后Sevilla等[28]以蔗糖和淀粉为原料,研究了不同水热温度、水热反应时间、糖类浓度、糖类类型等条件下形成微米碳球的过程机理,通过元素分析、红外光谱、拉曼光谱和光电子能谱表征,认为水热碳是一种核壳结构,核为芳香烃聚合而成,外壳富含多种含氧官能团(羟基、酚羟基、羰基、羧基等)。以淀粉为例,淀粉水解主要形成麦芽糖和葡萄糖,在水热条件下,高含量的离子产物如氢离子、氢氧根离子,诱发了水解反应;另一方面,这些单糖会形成有机酸,如乙酸、乳酸、丙烯酸、乙酰丙酸和甲酸,使pH快速降低到3以下,单糖发生脱水及分子键断裂(开环及C-C键断裂)生成一些可溶性中间产物,例如糠醛类化合物(糠醛、5-羟甲基糠醛、5-甲基糠醛)、有机酸、醛等。糠醛类化合物会进一步发生聚合、缩合等反应形成可溶性大分子,最后大分子产物芳构化(羟基脱水形成：C=O,中间产物发生酮-烯醇互变异构或者分子内脱水形成C=C)形成了碳微球的疏水芳核,边缘富含有羟基、羰基、羧基等多种功能基团的亲水壳层材料。Falco等[29]也研究了简单碳水化合物葡萄糖和木质纤维素生物质的水热转变过程,得到了类似的结论,认为初始阶段葡萄糖主要脱水生成5-羟甲基糠醛,并进一步通过聚合缩聚反应生成聚呋喃类化合物,成核阶段呋喃环类化合物进一步生成聚合物相从水中分离,生成固体水热碳材料。研究发现反应温度对该水热碳转化过程有较大影响。一方面,调控温度可以控制生成粒子的尺寸和大小分布,当葡萄糖在低于160 ℃下进行水热反应时则没有固体产物产生;另一方面,水热反应产生的碳材料的芳构化程度高度依赖于水热反应的温度,高温有利于生成芳构化程度高的水热碳产物。

表1 水热碳材料的制备及应用

F127: poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol) diacrylate; VPA: vinylphosphonic acid; MSA: [2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl) ammonium hydroxide; MPC: 2-methacryloyloxyethylphosphoryl-choline; BET: brunauer-emmett-teller; Ti-IMAC: Ti-immobilized metal ion affinity chromatography.

不同生物质原料,其反应机理也有差异。Kang等[30]分别以D-木糖、木质素、纤维素和木屑作为碳源在225～265 ℃之间进行水热反应,针对不同糖源,提出了对应的水热碳形成机理:D-木糖水热条件下会脱水形成糠醛,然后聚合为形状完好的碳微球;木质素由于温度限制很难分解,反应以固固反应为主,未溶解的木质素异构热解生成多环芳烃,溶于水的木质素降解重新聚合为酚醛树脂类的水热碳;纤维素主要通过两条路径,一是溶解了的纤维素水解为葡萄糖,进而生成水热碳球,另外也有部分纤维素直接热解转变为水热碳。木屑在水热条件下主要降解为半纤维素,半纤维素溶于水聚合生成水热碳。他们计算了4种原料的水热碳产率,均在45%～60%之间,比较发现产率最高的是木质素。

1.2 水热碳材料应用进展

水热碳材料目前在不同领域得到了广泛的应用(见表1)。由于水热碳材料可直接通过空气煅烧去除,因此常被用于制备空心材料的模板剂[31,32],去除水热碳材料以后的空心结构材料可应用于催化和药物控释[33,34];因其具有丰富的空隙、比表面和良好导电性特点也被广泛用于超级电容器材料[35]。水热碳因其具有快速吸附动力学和高吸附容量,且其表面成分和性质可通过化学处理从而增加其吸附容量,而用作吸附剂,很多报道表明该材料可以去除水中的金属离子(铜、铅、镉、铬)、染料分子及放射性元素铀等。如Li等[36]通过水热法制备出葡萄糖碳纳米球,并将其负载到蒙脱土上,合成了蒙脱土负载碳球的蒙脱土吸附剂(montmorillonite supported carbon nanosphere adsorbent, Mt-spC)用于除去水溶液中的铬离子,实验结果显示该材料的吸附量达到156.25 mg/g,远大于蒙脱土和其他吸附剂。Demir-Cakan等[18]在水热过程中加入丙烯酸,合成了羧基修饰的水热碳,对重金属离子铅和镉离子的吸附量有显著提高,分别达到351.4和88.8 mg/g,可作为廉价吸附剂在温和条件实现对水的纯化。Song等[37]使用氢氧化钠对葡萄糖碳基微球进行活化,然后将其用于亚甲基蓝、龙胆紫、孔雀石绿等碱性染料的吸附,结果表明该材料对3种染料有良好的吸附性能,其吸附量分别达到了682、395和310 mg/g。而且该材料可以再生,经过7次循环使用,仍保持96%的吸附容量。对于放射性铀的吸附研究,刘云海等在水热碳合成过程中添加少量乙烯基功能化单体,制备了磷酸化水热碳微球(HTC-PO4)[38]、偕胺肟化水热碳微球(HTC-AO)[39]和酰胺化水热碳微球(HTC-AM)[40],极大地提高了水热碳微球对铀(VI)的吸附容量和选择性,在最佳条件下其吸附容量分别为434.78、724.6和588.2 mg/g。研究表明,对铀的吸附都是以化学吸附为主的自发吸热过程,其中磷酸化后的水热碳微球对铀的选择性有较大的提高。

图2 表面季铵化基团修饰的蔗糖水热碳球应用于离子色谱固定相[47]

上述结果均表明水热碳材料可与多种分子离子发生相互作用,其表面丰富的含氧官能团以及易于修饰的特点可有效调控其吸附容量和吸附选择性。除吸附剂之外,近年来,水热碳材料在分子和离子的高效分离富集分析中作为固相基质材料也得到了初步的应用(见表1)。下文重点对近年来水热碳材料在离子化合物分离、极性化合物分离、磷酸化肽段及糖基化肽段的高效分离分析等方面的最新研究进展进行综述,并作简要展望。

2 水热碳材料在色谱分离分析领域的应用

2.1 离子化合物分离

图3 环糊精水热碳修饰硅胶固定相的合成示意图[43]

离子色谱(IC)是在环境、食品、医学科学中分析离子型化合物的有力工具,近年来发展十分迅速。离子色谱分离机理主要是离子交换,是基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换,依据这些离子对交换剂有不同的亲和力而被分离,与树脂亲和力较弱的离子优先通过柱子,保留时间较短。离子色谱流动相通常为酸碱体系,因此其固定相要求耐酸碱腐蚀。由于聚合物填料耐酸碱有机溶剂,其中以聚苯乙烯二乙烯苯(PS-DVB)和乙烯基苯二乙烯基苯(EVB-DVB)微球为基质的固定相发展迅速,通过在微球表面进行不同修饰可实现不同离子的高效分离,比如磺酸化后可作为阳离子交换固定相[46]。然而,由于这类基质的化学惰性,其修饰方法比较有限。最近,在离子色谱固定相的研究中引入了水热碳的基体材料,2016年,朱岩课题组[47]利用葡萄糖作为碳源,通过在水热反应中加入聚合物模板剂可控合成微米级且尺寸均匀的水热碳球。将其用作基体微球且进一步季氨基化改性修饰,其碳球合成和修饰过程见下图2,在0.01 mol/L氢氧化钾流动相条件下,对常见的7种无机阴离子(氟离子、甲酸根离子、氯离子、亚硝酸根离子、硫酸根离子、溴离子和硝酸根离子)表现出良好的分离效果,可于13 min内完成分离,且色谱峰对称无拖尾,这是由于水热碳球有高亲水表面和低非特异性吸附的优势。在氢氧根离子洗脱剂冲洗2.5×104柱体积后,依然具有很高的稳定性,其相对标准偏差(RSD)值小于0.45%,分离柱效为6 800～15 500 N/m,相比于商品化的PS-DVB基质球表现了优异的亲水性和易修饰性能。2017年,Zhao等[48]利用蔗糖作为碳源制备水热碳球,通过接枝高分子层数的增加,将离子交换容量从26 μmol提高到92 μmol。进一步,对极性阴离子,如硫酸根离子、高氯酸根、磷酸根等有稳定的分离特性。对实际样品茶叶中氟离子的定量限可以到达0.16 mg/g。其耐酸碱性、机械稳定性和良好的分离性能结果显示了水热碳材料是极有潜力的离子色谱固定相。2019年Zhao等[49]利用葡萄糖为原料,在制备的水热碳的基础上进一步合成了多孔碳球(PCNS),经过季胺化和环氧胺反应被修饰到磺酸化的聚苯乙烯和二乙烯基苯微球表面形成附聚型离子色谱固定相。该附聚型固定相可通过控制层数来调节柱子峰容量和阴离子的保留时间,附聚层数越多峰容量越大,阴离子的保留时间越高,并且此种固定相良好的通透性缩短了分析时间,可用于快速分离复杂样品,柱效可达38 400～13 200 N/m,通过8天的测试,其柱效和分离稳定性的RSD低于2%。水热碳材料作为离子色谱固定相依然存在柱效低且修饰方法单一的问题,因此新型水热碳材料的合成及新的水热碳修饰方法的研究会为离子色谱固定相的选择提供新思路。

2.2 极性化合物分离

由于极性化合物在反相色谱模式下保留作用弱,其主要依靠亲水相互作用色谱(HILIC)模式分离分析。HILIC是一种在高有机相条件下利用极性固定相与极性化合物的静电、氢键等作用力,分离极性化合物的液相色谱模式[50]。近几年,各种商品化和学术报道的HILIC极性固定相材料种类日益丰富,涵盖了未衍生硅胶[51]、氨基[52]、氰基[53]、二醇基[54]、酰胺型、聚(琥珀酰亚胺)型[55]、糖型[56]和离子液体[57]键合硅胶等,已广泛应用在极性药物、蛋白质组学、代谢组学分离分析等方面。其中,将葡萄糖、麦芽糖[58]、环糊精[59]、环聚果糖-6[60]、壳寡糖[56]等糖类小分子通过点击化学反应键合于硅胶表面是研究应用最广泛的一种,其合成条件苛刻,需使用大量有机溶剂。由于水热碳是一种由糖类水热转变合成的绿色产物,具有亲水性和表面多功能基团的优势,Zhao等[43]于2019年首次将由环糊精在低温水热条件下衍生的水热碳材料涂敷于硅胶微球材料(silica@HTC,见图3),制备了高度均匀且表面亲水的基质材料,并将其填充于色谱柱中,用于HILIC模式下极性化合物的分离。其柱效相比于硅胶及商品化填料并未损失,而且远高于纯碳微球色谱固定相。研究者进一步考察了在亲水模式下对酚类、内分泌干扰物(如雌二醇、双酚A、辛特基酚)等极性化合物的分离能力,均优于商品化纯硅胶及二醇基和氨基修饰硅胶亲水固定相。尤其是对化合物双酚A,其保留因子(k3=5.25)显著优于商品化氨基修饰硅胶柱(k3=0.66)。该工作利用了色谱硅胶作为内核模板,提高了水热碳材料的分散性和尺寸均匀性,成功将水热碳材料应用于HILIC的固定相研究领域。随着亲水色谱研究的逐步深入,新型高选择性、高亲水性的色谱固定相依然是亲水色谱发展的关键。由于HILIC模式下水热碳材料与极性化合物的强相互作用,其有望成为HILIC固定相的发展趋势。然而,水热碳材料的制备均匀性和表面孔隙仍需进一步调控,以实现高效分离分析的需求。此外,有效利用功能化后的水热碳材料对极性化合物进行分离分析,特别是在规模化制备纯化方面具有广阔的应用前景。

图4 表面磷酸基团修饰的葡萄糖水热碳材料的制备流程及人血清磷酸化肽在Ti-IMAC碳材料(a)富集前和(b)富集后的质谱图[44]

2.3 磷酸化肽段分析

固定化金属离子亲和色谱(IMAC)是一类重要的磷酸肽富集分析方法,其富集原理是在亲水基质表面螯合金属离子,利用被固定金属离子剩余位点对磷酸化肽进行选择性分析。传统的固定化金属离子亲和色谱主要以亚氨基二乙酸、次氨基三乙酸等配合基团固定铁离子、镓离子等金属离子,但是该方法的主要缺点是特异性不高,在富集磷酸肽的同时酸性肽段也会被富集[61,62]。邹汉法等[63]发展了一种以磷酸基团为配合基团的新一代固定化金属离子亲和色谱材料。在该方法中,磷酸基团以共价键连接到固相载体上,而后利用钛离子、锆离子与磷酸基团之间强的相互作用固载于固相载体表面,被固定的钛离子、锆离子上剩余的配合位点可以选择性地将磷酸化肽富集,该方法已经被证明具有非常优越的富集性能,比传统的固定化金属离子亲和色谱、金属氧化物亲和色谱等方法具有更好的富集特异性。

为了进一步提高抗干扰性能,Zhao等[64]发展了PEG修饰的高亲水基底材料,并在该材料表面进一步修饰磷酸根和钛离子,该材料对磷酸肽的富集选择性高达1∶2 000;在此思路上,Zhang等[65]发展了亲水的等级孔整体材料基底,其对磷酸肽的富集选择性高达1∶1 000; Peng等[66-68]合成了双金属中心有机骨架化合物亲水基底,提高了螯合金属离子位点数,对磷酸化肽的富集选择性达到1∶5 000。这些研究表明,提高基质材料的亲水性和表面金属螯合位点可提高对磷酸肽的高效、高特异性富集。鉴于水热碳材料表面的高亲水性和易于修饰等特点,2019年,Zhang等[44]发展了以水热碳材料为固相载体,通过在合成过程中加入乙烯基磷酸单体,一步制备了磷酸根修饰的水热碳材料(见图4)。进一步在表面螯合钛离子制备了Ti-IMAC碳球材料,该材料对标准磷酸化酪蛋白酶解液中的磷酸化肽段实现了高选择性富集,检测限低至5 fmol,抗牛血清白蛋白酶解液的干扰物质的量的比可达到1∶1 000。将该材料应用于实际血清样品中低丰度磷酸化肽的富集,MALDI质谱检测到4条高信噪比的低丰度磷酸化肽段,表明该材料对于复杂生物样品中低丰度磷酸化肽的高抗干扰、高特异性富集能力。水热碳材料作为一种新型亲水富集基质,其表面性质仍可进一步调控,如可在材料制备过程中加入亲水功能配体,进一步提高表面亲水性和离子固载量,提高抗干扰性能和富集效率;将其尺寸调控至微米级,作为色谱柱填料实现原位磷酸化肽段富集和检测;此外,通过在其表面修饰可与多磷酸化肽相互作用的配体可用于多磷酸化肽富集;调控水热碳材料的孔隙结构,提高比表面积,用于痕量临床样本的分析。

图5 一步法合成两性离子单体修饰水热碳HTC-Glc-x% MPC或HTC-Glc-x% MSA的工艺流程及糖基化肽段的富集过程图[45]

2.4 糖基化肽段分析

蛋白质糖基化修饰是一种重要的翻译后修饰,蛋白质糖基化分析对深入认识其生物功能和发现生物标志物意义重大。然而生物样品中高浓度的蛋白质、脂质、盐等严重干扰了低丰度糖基化多肽的质谱分析,因此在糖基化多肽质谱分析前对其进行高效富集至关重要。目前糖基化多肽富集策略主要通过富集材料的特异性亲和位点对糖基化多肽进行富集,其中利用亲水作用色谱富集(HILIC)是比较普适性的策略。许多HILIC载体比如介孔硅[69]、磁性纳米粒子[70]、金属有机骨架[14]、共价有机骨架[71]、大孔树脂[72]等广泛用作糖基化多肽富集分析的基底材料。Wang等[73]报道了一种两亲性的亲水介孔材料,将其应用于唾液中内源性糖基化多肽的分析,LC-MS/MS可检测到40条内源性糖基化肽段。Peng等[74]在亲水金属有机框架化合物基底上进一步通过高亲水性的生物分子二磷酸果糖(FDP)对其表面进行调控,结果显示该双亲水表面对非糖基化多肽(抗干扰物质的量的比1∶5 000)和高分子蛋白质(抗干扰物质的量的比1∶1 000)具有较高的抗干扰能力,可从5 μL人血浆中鉴定到380条内源性糖基化肽段以及180个非冗余糖基化位点。

两性离子功能材料因可与糖肽的糖链形成多价键相互作用,被广泛用于亲水基底材料的表面修饰,以提高对糖肽的特异性识别[75]。基于水热碳材料的高亲水性,2019年,Li等[45]用葡萄糖作为原料,在水热反应条件下,添加两性离子如2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(2-methacryloyloxyethylphosphoryl-choline, MPC)和[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵([2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl) ammonium hydroxide, MSA)单体,通过一步法合成了两性离子修饰的水热碳HTC-Glc-x%MPC和HTC-Glc-x%MSA材料。此项工作结果显示,HTC-Glc-10% MPC对N糖基化肽段具有高特异性灵敏度和选择性,可从150 fmol免疫球蛋白酶解液里富集到26个信噪比大于20的N糖肽,检测限达到5 fmol,对非糖基化的BSA酶解液多肽的选择性达到了1∶100,从2 μL人血清中共鉴定到92个糖蛋白中285个N糖基化肽段的175个N糖基化位点,这个数量超过了之前报道的许多材料[76-78]。其材料的合成过程与糖基化肽段富集分析流程见图5。相比其他富集材料,水热碳是一种可有效利用生物质且合成过程简单省时的绿色碳材料,其亲水表面表现出高效的抗干扰性能和良好的生物相容性,或可更有利于活体在线分析糖基化肽段,为糖肽富集分析的研究提供新思路。

3 总结与展望

上述研究初步揭示了水热碳材料在色谱及样品预处理领域的应用前景,水热碳材料作为一种表面亲水且易于改性的功能材料,在分离分析领域已得到了初步的尝试。其表现出的优良的抗干扰性能和可修饰性,有望在复杂样品分离分析中发挥独特的作用。笔者认为当前水热碳的研究面临的挑战主要为:(1)作为色谱固定相,其尺寸大小、均匀性和分散性的控制至关重要。目前合成的水热碳球粒径较小,并未广泛应用为色谱固定相;(2)目前合成的水热碳为无孔或微孔结构,发展介孔及大孔的水热碳固定相更有利于色谱分离分析;(3)水热碳比表面积小,因此吸附容量低;(4)当前水热碳种类稀少,需要开发新的合成及修饰方法,以满足不同实际样品的分离分析需求。随着水热碳微球材料形成机理的进一步研究,及对水热碳材料的粒径、孔结构、比表面积、合成和修饰方法等的调节研究,将促使研究人员开发更多新的潜在用途。

综上,水热碳材料来源于生物质的转变,原料广泛,避免了反应过程中有机溶剂带来的环境污染问题,符合绿色环保的概念,因此具有较大的研究空间;其高度亲水和易修饰的特点,有利于制备功能多样性材料及复合材料,也可满足更多的应用需求,因此开展水热碳材料的色谱分离和样品富集分析固定相研究将是一个非常有前景的方向。