核壳型二氧化硅色谱填料的研究进展

夏红军, 刘家玮, 白 泉*

(1.教育部天然与功能分子化学重点实验室, 西北大学现代分离科学研究所, 陕西省现代分离科学重点实验室, 西北大学, 陕西 西安 710069; 2.河南省稀土功能材料重点实验室, 周口师范学院, 河南 周口 466000)

高效和快速分离分析始终是色谱工作者追求的目标。近年来,基于亚-2 μm填料、整体柱和核壳型填料以及超高压液相色谱技术,使复杂样品的快速分离分析得以实现。虽然亚-2 μm填料在样品快速分离分析中表现出了显著优势[1],但进一步降低填料的粒径以获得更高柱效则存在很大局限性。填料粒径减小,柱压显著升高,不仅造成色谱柱装填困难,而且不得不使用价格昂贵的超高压液相色谱仪[2]。此外,高压驱动下流动相与填料之间产生摩擦热而导致的径向温度梯度,会造成色谱峰展宽,这些因素都限制了其柱效的进一步提高。

图1 不同孔道结构的二氧化硅核壳微球

二氧化硅核壳填料因其特殊的结构,既能保持现有小粒径填料高效快速分离的优势,又能降低背压,在快速分析中表现出了优越的分离性能,近年来逐渐引起色谱工作者的关注[3,4]。核壳型填料的概念是由Horvath等[5]于20世纪60年代末提出的。与全多孔微球不同,它是在实心核外包裹一层多孔壳,也被称作表面多孔微球,如图1所示。其设计的初衷是为了缩短溶质扩散的路径,并在给定流速下保持较低的背压。核壳型填料的开发始于Horvath和Lipsky[6]制备出了一种大粒径的薄壳微球并用于离子交换分离。从那时起,这种微球的发展经历了几个活跃和停滞不前的周期[7]。Kirkland[8]制备出了用于气相-液相色谱的壳层厚度和孔径可控的第一代薄壳微粒,材料的粒径较大。1992年,随着Agilent公司采用喷雾干燥法成功制备出粒径5 μm的Poroshell 300,标志着核壳型二氧化硅色谱填料进入了第二代[9]。2006年,Advanced Material Technologies公司推出了粒径为2.7 μm的Halo核壳型二氧化硅微球,才使得核壳微球的概念正式成型[10,11]。Halo核壳型硅胶色谱填料,由1.7 μm的实心硅胶核和0.5 μm的多孔壳层组成[12]。粒径2.7 μm的SiO2核壳填料能够达到亚-2 μm全多孔填料的分离效率,而背压仅与3 μm全多孔填料相当[13],其优异性能引起了整个分离领域的高度关注。自从Halo色谱柱上市以来,Agilent、Thermo和Phenomenex等公司也相继推出了自己的核壳型色谱柱。表1中列出了主要品牌的核壳色谱柱产品及相关的参数。最初的核壳色谱柱主要填充粒径为2.6和2.7 μm的核壳填料,孔径约为100 Å(1 Å=0.1 nm,下同),仅用于小分子的快速分离。考虑到孔径大小对小分子和生物大分子分离的影响,如表1所示,大多数制造商提供两种不同孔径的产品系列:一种孔径为80～100 Å,用于小分子的分离。另一种具有150～300 Å的大孔,用于多肽(150～200 Å)和蛋白质(>300 Å)等生物大分子的快速分离。此外,厂家还推出不同粒径的核壳填料,如更小粒径的亚2 μm及大粒径5 μm的核壳填料。采用亚2 μm核壳填料可获得更高的分离度。

核壳填料与亚-2 μm无孔填料相比,具有上样量大、色谱柱通透性好,背压低等优势。与5 μm全多孔填料相比,该填料可显著缩短分析时间,改善分离效果,提高灵敏度和分辨率[14,15]。因此,核壳型填料被认为是全多孔硅胶填料真正的替代品,已成为液相色谱超快分析的理想工具[16]。本文以二氧化硅核壳型色谱填料为核心,对其分离机理、制备方法及其在快速分离分析中的应用和最新动态进行综述,并对其发展进行了展望。

1 SiO2@SiO2核壳填料快速高效分离的机理

核壳型填料由于其特殊的结构,均一的硅胶核使其具有更窄的粒径分布,而多孔的壳层使溶质扩散具有较短的路径,因而具有更高的柱效。依据范迪姆特方程,如(1)式所示,来讨论核壳填料的A、B、C3项对理论塔板高度H的贡献。

H=A+B/u+Cu

(1)

式中A、B、C为常数,u为流动相的线速度。

A项为涡流扩散项。核壳填料具有较好的单分散性和较为粗糙的表面结构,可有效降低A项。理论认为,色谱柱填料的单分散性对涡流扩散项影响较大。因为相同条件下,色谱填料的单分散性越差,装填时色谱床层越不均匀,会引起A项增大,导致色谱峰展宽。反之,粒径单分散越均匀,A项就越小。二氧化硅核壳填料的一大优势就是均匀的硅胶核使核壳微球的粒径分布均匀,增加了色谱柱装填的均匀性[17],可有效抑制涡流扩散,可使A项减小高达40%[18]。此外,与全多孔填料相比,核壳填料具有更粗糙的表面,可防止颗粒之间的滑动和柱床的膨胀,保持柱床的稳定性和均匀性。

B项为纵向分子扩散项。核壳填料具有更好的通透性,可允许使用更高的流速。高流速有利于减小溶质的纵向扩散,与全多孔填料相比,可使B项降低25%[19]。全多孔填料色谱柱的死体积约占柱体积的三分之一,而装填核壳填料可使柱死体积减小20%～30%[20]。减小柱子的死体积,可抑制溶质的纵向扩散。此外,核壳填料的固体内核占总柱体积的25%,具有更好的导热性,有利于减小径向和轴向温度梯度引起的谱带展宽[21]。溶质的纵向扩散不能通过固体核,这是使B项降低的重要原因[19]。

C项为传质阻力项。流速增大,C项亦增大。研究表明,无论采用全多孔填料还是核壳填料,对于小分子而言,其传质阻力项都很小或可忽略不计,带扩展的减小主要源于A项和B项的减小。但对于具有较小扩散系数的生物大分子,如蛋白质、寡核苷酸等,壳层厚度对其分离效果影响较为明显。与全多孔填料相比,在高流速下核壳填料可显著降低蛋白质等生物大分子的C项。随壳层厚度的减小,核壳填料的分离效率提高[22],这也是核壳填料更适合蛋白质、多肽等生物大分子快速分离的原因。Kirkland[23]认为对于大分子最佳的壳层厚度为200 nm。

总之,核壳填料在快速分离中表现出优越的分离性能,可归因如下:(1)色谱柱具有更好的通透性,背压低,允许使用更高的流速[24]; (2)传质路径短,减小了纵向扩散;(3)粒径分布窄,柱床装填均匀,有利于降低涡流扩散;(4)核壳填料散热性能好,有利于减小径向和轴向温度梯度引起的谱带展宽。

2 SiO2@SiO2核壳微球的制备

核壳微球的制备通常通过两步或多步实现。首先制备无孔核,然后在核表面包覆多孔壳层。多孔壳层可以由纳米颗粒、纳米纤维或者纳米棒的聚集形成。纳米结构之间的孔隙是HPLC进行色谱分离的基础。目前SiO2核壳微球的孔道结构主要分为两种[25]:一种是由纳米级二氧化硅粒子的无序堆积形成的,多孔壳层形成的孔道是随意分布的,孔径分布较宽。孔径大小主要由纳米颗粒的尺寸决定,纳米颗粒的随机聚集形成曲折的孔道结构,如图1b所示。这类孔结构在分离时增大了溶质的分离路径,一定程度上造成了峰展宽和分离时间的增加。另一种是通过假晶转换过程制备的放射性介孔通道。该种孔道结构是以阳离子表面活性剂为模板通过假晶转换过程形成的,具有高度有序性,结构如图1a所示。放射性介孔通道有利于减小纵向扩散,提高整体分离效率,理论研究也证实了该种放射性介孔通道能够有效减小溶质分子的纵向扩散[26]。下面对几种主要的制备方法作一简介。

2.1 层层自组装法

目前用于色谱分离商品化的二氧化硅核壳型色谱填料主要通过层层自组装(layer-by-layer, LBL)技术制备[27-30]。该方法利用静电相互作用将带正电荷的聚电解质和带负电荷的硅胶纳米粒子反复多次组装在硅胶表面,最后通过煅烧除去有机物,得到核壳型二氧化硅微球。2007年Advanced Material Technology公司率先推出了二氧化硅核壳填料(Halo柱)。该核壳微球由1.7 μm的实心硅胶核和0.5 μm的多孔壳层组成[21]。LBL是通过二氧化硅纳米粒子的自组装次数来控制核壳材料的壳层厚度,而孔径的大小则通过调整硅溶胶纳米粒子的尺寸来调控。由于LBL法一次只能包覆一层硅胶粒子,需要反复几十次层层组装才能达到所需的壳层厚度。在每次包覆过程之间都必须通过过滤或离心除去剩余的聚合物和硅胶纳米粒子。因此该方法制备过程繁琐,耗时费力,产率低,成本高[31]。为了解决这个问题,开发了多层自组装技术(multilayer-by-multilayer, ML-B-ML)[32-34]。该方法通过一次自组装过程能将6～7层纳米粒子包覆到硅胶核表面,简化了制备核壳微球的制备工序,大大提高了制备速度,且具有更好的孔隙率。但该方法仍需多次组装才能达到所需壳层厚度,不能从根本上解决其耗时费力的问题。

2.2 模板法

模板法是在传统的凝胶体系中加入实心硅胶核,并以季铵盐作为模板剂,诱导硅源单体在核表面水解聚集,从而生成放射性有序介孔的壳层,煅烧后得到二氧化硅核壳微球。Unger等[35]以十二烷基胺、十六烷基胺为模板剂和致孔剂,制备出了壳层厚度为70 nm,孔径为2～5 nm的二氧化硅核壳微球。但是以小分子阳离子表面活性剂(如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB))为模板剂时,制备的核壳微球的介孔孔径一般小于4 nm,不能满足用于分离小分子的商业化微球(一般孔径为9～12 nm)的要求[36],这就限制了其在色谱分离中的应用,因此需要对其进行扩孔。当采用聚乙二醇[37]、三嵌段共聚物EO20PO70EO20[38]、F127P123P105[39]以及聚乙烯醇(PVA)[40]等作为模板剂时,虽然可以制备出6～12 nm较大介孔的核壳微球,但介孔的通道与二氧化硅核表面平行,这种壳层结构并不利于色谱分离效率的提高。

最近,本课题组发展了一种双模板法制备具有较大放射性介孔结构的二氧化硅核壳微球的新方法[41,42]。该方法在碱性条件下,以无孔硅胶为核,正硅酸乙酯(TEOS)为硅源,CTAB和三辛基甲基溴化铵(TOMAB)为双模板剂,制备出了孔径为10.6 nm、壳层厚度为198 nm、具有较大放射性介孔结构的二氧化硅核壳微球。通过调控CTAB和TOMAB的物质的量比以及模板剂浓度和加料方式,实现二氧化硅核壳微球壳层厚度和孔径的可控制备。所制备的二氧化硅核壳填料具有较大放射性孔径,无需进一步扩孔,可直接用于小分子溶质的快速分离分析。

2.3 模板溶解诱导再沉积法

Di Renzo[43,44]课题组提出了在强碱性条件下通过假晶转化制备具有有序介孔结构的二氧化硅微球的方法。该方法主要通过对无孔硅胶微球表面的刻蚀再沉积得到多孔的二氧化硅核壳微球,所制备的核壳微球具有高度的均一性,其尺寸与无孔硅胶微球的粒径基本一致。Dong等[45]在十六烷基三甲基氯化铵和NH4F存在下,使用一锅模板溶解和模板再沉积混合方法,制备出具有独特的双有序孔结构的硅胶核壳微球。内层为虫孔状介孔结构,孔径为4.5 nm,外层壳为放射性的介孔结构,孔径为5.2 nm,壳层厚度可通过调节刻蚀时间和反应温度来控制。Min等[46]利用模板溶解诱导再沉积法制备出粒径为1.9 μm、壳层厚度为180 nm,孔径为4.9 nm的核壳微球,通过氢氟酸回流的方法进行孔径调节,扩孔至10 nm和15 nm。通过C18改性,在反相色谱模式下对烷基苯同系物、多肽和蛋白质进行了快速分离。其课题组又以N,N-二甲基癸胺(DMDA)和十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)为模板制备出具有双重孔径结构的核壳微球,该法进一步提高了孔径尺寸[47]。总之,该方法简单方便,可以通过刻蚀时间来实现壳层厚度的可控,粒径分布窄,解决了核壳微球制备过程中微球团聚和二次成核问题,不足之处是刻蚀过程所形成介孔结构的机械稳定性较低,孔径较小,需扩孔才能应用于生物大分子的分离分析。

2.4 聚合诱导胶体聚集法

Kirkland等[48]首次采用聚合诱导胶体聚集技术(polymerization-induced colloid aggregation, PICA)制备微米级的二氧化硅核壳微球,并通过调节二氧化硅纳米粒子的粒径调控孔径大小。该方法操作简单、成本低、耗时短,有利于扩大生产。但制备出的二氧化硅核壳微球单分散性较差,粒径分布宽,需通过分级才能用于色谱分离[49,50]。Chen等[51,52]对此方法进行了改进和优化,以脲醛树脂为模板,一步将带异种电荷的硅溶胶纳米粒子沉积到无孔核表面,最后通过煅烧除去模板剂,形成核壳结构,简化了实验步骤,节省了时间和成本。但仍不能解决制备过程中的微球团聚和硅胶纳米粒子二次成核问题。基于此,本课题组[53,54]改进了硅胶核的改性方法并对反应条件进行了优化。对无孔硅核表面改性时采用乙醇高温回流的方法,解决了改性后硅胶内核易发生团聚的难题,成功制备了单分散性良好的γ-脲丙基三甲氧基硅烷改性硅核,并通过对pH、温度、硅溶胶浓度等条件的优化,成功解决了利用PICA法制备二氧化硅核壳型微球过程中易出现二次成核的难题。该技术制备出的核壳微球的壳层厚度可通过改变核/壳投料比调控,孔径主要是SiO2纳米粒子堆积形成,可通过调节硅溶胶纳米粒子的粒径调控孔径的大小,并通过调节硅溶胶和脲/醛树脂的摩尔比来控制孔隙率。

2.5 双相法

Polshettiwar等[55]利用微波辅助水热技术在两相体系内制备出具有较高比表面积的纤维状纳米二氧化硅微球。较传统的介孔二氧化硅纳米微球具有比表面积高、孔径大、机械稳定性高等优点。Yu等[56]将Fe3O4纳米粒子分散到水相,正硅酸乙酯(TEOS)分散到环己烷中,通过水热反应将纤维状的二氧化硅成功包覆到Fe3O4微球表面,制备出具有纤维状壳层结构的Fe3O4@SiO2核壳微球。然而此方法只能应用于纳米级颗粒,且孔径仅为3.7 nm。Shen等[57]利用改进的两相法,在油水两相体系中制备出孔径在2.8～13 nm范围内可控的具有树枝状结构的大孔纳米二氧化硅微球。Min等[58]将此方法扩展到制备微米级核壳二氧化硅微球。首先以阳离子表面活性剂CTAB为模板、以TEOS为前驱体、尿素为催化剂、正己烷为有机油相,使用油水两相体系实现树枝状介孔氧化硅在实心二氧化硅微球表面的连续均匀包覆。通过条件控制实现材料壳层厚度13～67 nm、孔径尺寸5～6 nm范围内的可控制备。该方法利用搅拌所产生的剪切力使油水两相在CTAB参与的条件下形成水包油半乳液胶束。同时,油相中的TEOS可扩散至油水界面处发生水解缩聚生成硅酸盐低聚物,然后定向排列在半乳液胶束弯曲界面的亲水性区域,到达临界成核浓度时进入水相引发成核。硅核在静电相互作用及亲疏水作用的共同牵引下吸附于二氧化硅内核表面,成为树枝状介孔壳层的生长点。随纳米粒子的不断形成和堆积,最终实现树枝状介孔氧化硅对实心氧化硅微球表面的连续均匀包覆[59]。双相法操作过程简单,制备的核壳微球具有较高的比表面积和较大的孔径尺寸,但壳层厚度和包覆均匀性受搅拌速度影响较大,壳层较薄,且反应条件较为苛刻,极易产生二次粒子。李彤等[60]将这种具有放射状孔道的核壳型C18改性的色谱柱应用于汽车尾气中醛酮类化合物的检测,在优化的色谱条件下,2,4-二硝基苯肼衍生的全通类化合物在15 min内获得了较好的分离效果,与传统的全多孔固定相相比具有明显的优势。该固定相可在常规高效液相色谱仪上实现高效、快速的分离分析,为环境、食品、医药、生物等领域的高通量分析检测提供了技术参考。闫超等[61]将1.2 μm放射型核壳色谱填料应用于加压毛细管电色谱中,在8 min内实现8种中性物质的基线分离,表明1.2 μm放射型核壳色谱填料适用于加压毛细管电色谱法的分离分析,进一步拓展了核壳填料的应用领域。

2.6 一锅煮法制备SOS核壳微球

Ahmed等[62,63]使用单一硅源3-巯丙基三甲基硅烷(MPTMS),通过“一锅煮”制备了spheres-on-sphere(SOS)核壳微球。首先制备聚乙烯醇(PVA)和CTAB的水溶液,边搅拌边向溶液中加入甲醇、氨水和MPTMS,室温下搅拌反应24 h即可得SOS核-壳微球。该反应分两个阶段进行。首先形成纳米级的硅胶粒子并逐渐生长至微米级,然后在30 min时新的纳米级硅胶粒子开始在微米级硅胶粒子表面形成,180 min后形成了SOS核-壳微球,此后SOS微球的形貌不再发生变化。由SOS核壳微球填装的色谱柱能够在低背压下快速分离蛋白质。该方法操作简单,耗时短,成本低,有利于工业化生产。但由于SOS微球孔径太小,不能满足色谱分离对孔径的要求[64],从而减少了其有效分离面积,大大影响其载样量和分离效率。

3 SiO2@SiO2核壳型填料的应用

核壳填料因其独特的结构,在快速分离分析中表现出高柱效、高分辨和低背压的特点,既满足了高通量和高分辨的分离要求,又能保证样品具有合适的保留和载样量[65],因其优异的色谱性能已广泛应用于医药、食品和环境等多个领域样品的快速分离分析。

3.1 小分子的快速分离分析

在药物分析方面,Majors等[66]对比2.7 μm粒径的核壳柱和1.8 μm粒径的全多孔柱在超快速条件下分离对羟基苯甲酸甲酯的分离效果,结果表明其分离性能接近1.8 μm粒径的全多孔柱,而且2.7 μm核壳柱进行分离时所产生的背压更小。进一步证明了高效低背压的分离特点是核壳填料在色谱分离时的主要优势。另外,核壳填料粒径均一,可有效提高色谱柱床装填的均匀性,大大提高柱效。Ahmad等[67]采用2.7 μm核壳填料在15 s内就完成了对苯妥英的分离,柱效达4 000块/m,压力约为60 MPa,这主要得益于核壳填料优异的单分散性。Cunliffe等[68]采用2.7 μm核壳填料,应用LC-MS技术建立了对人血浆中泊沙康唑进行快速分离的新方法,该方法比文献报道的分离速度快4倍。较高的分离速度得益于核壳填料的特殊结构,其多孔壳层在分离时缩短了传质路径,有效提高了分离效率。Kirkland等[69]使用高极性聚羟基配基改性Halo核壳微球,在亲水色谱模式下对反相色谱难以分离的物质进行分离,实现了对15种常见药物和特定代谢产物的高效分离。核壳填料在亲水作用色谱中的应用极大地扩展了核壳柱在药物分析中的应用范围。何嘉雯等[70]采用装填了2.6 μm Thermo Accucore C18核壳色谱柱建立了高效液相色谱快速测定草本植物饮料中28种外源性药物和内源性成分的分析方法。张晓艺等[71]第一维采用Kinetex Biphenyl反相核壳色谱柱,建立了二维超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱联用快速测定全血和尿液中鱼藤酮的检测方法,并成功应用于鱼藤酮中毒样品的检测。闫超等[72]采用核壳型Halo C18色谱柱,对水飞蓟素中7种非对映异构体进行了快速分离,并应用于市售水飞蓟制剂的分离检测,为水飞蓟素及水飞蓟制剂的分离检测提供了一种高效、准确、便捷的方法。

在食品分析方面,Armentano等[73]在反相色谱模式下利用2.7 μm粒径的核壳柱在传统高效液相色谱仪上实现了牛奶中13种磺胺类药物的快速定量检测,实现了常压色谱上的高效快速分离分析。食品中的天然污染物真菌毒素是一种低相对分子质量化合物,即使在低于1 μg/kg时仍具有很强的毒性,因此对其检测需要很高的灵敏度。在红葡萄酒的质量控制中,一种天然真菌毒素赭曲霉素A的检出限就要求必须低于2 μg/L。Mao等[74]利用2.6 μm Kinetex C18核壳色谱柱在低压下使用常规液相色谱仪,赭曲霉素A的检出限可低至0.002 8 μg/L。该方法证实了核壳色谱柱适用于高灵敏度的分离分析。核壳柱在食品中抗氧化剂和天然污染物分离分析中的应用也多见报道。Wu等[75]利用液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾离子化质谱(LC/DAD/ESI-MS)法在反相模式下比较了亚-2 μm全多孔EBH-C18填料和2.7 μm Halo C18核壳填料对洋蓟罐头中10种酚类化合物的分离性能。结果显示,核壳色谱柱在柱效、分离度、柱压和分析速度方面均优于全多孔色谱柱。Manns和Mansfield[76]利用核壳型2.6 μm Kinetex C18色谱柱成功分离了两种抗氧剂花青素和酚丁质,而通过五氟代苯基改性的2.6 μm Kinetex PFP核壳色谱柱对花青素分离效果更佳,并且应用该柱子成功分离了菊苣根中的位置异构体绿原酸和倍半萜内酯,这主要归功于柱子具有π-π和H-F相互作用力能提供不同的选择性。Fibigr等[77]利用反相氨基熔融核柱分离检测绿咖啡提取液中咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸,在8 min内实现了3种咖啡酰奎宁酸和2种二咖啡酰奎宁酸的快速分离和定量检测。

在环境检测方面,Pedrouzo等[78]利用2.7 μm Halo C18柱对废水中10种常见药物及其代谢产物进行检测,实现了常压条件下的快速检测。Gallart-Ayala等[79]利用在线柱切换技术将2.7 μm Halo C18柱应用于废水中双酚类物质的分析,在3 min内实现了高效快速的分离分析。Ciofi等[80]将较大粒径的核壳柱和在线固相萃取柱串联用于废水中雌激素类物质的分析和检测,与其他方法相比,该方法在保证高通量的同时,节省了分析时间,提高了方法的灵敏度。Fontanals等[81]利用在线SPE串联亲水色谱-质谱联用(SPE-HILIC-MS)法检测废水中极性违禁药物的含量,该方法能有效地检测出较低含量的极性分析物,提高了分析方法的灵敏性。农药广泛应用于防治庄稼杂草、病变和虫害,但它们也会对水及野生动植物造成污染,并对人类健康产生影响,但是农药被检测的浓度通常都很低,故需用高灵敏度的检测手段来分析。Hurtado-Sánchez等[82]发展了一种快速、灵敏的在线SPE-LC-MS/MS法,这种方法使用Poroshell 120 EC-C18核壳填料(粒径2.7 μm)装填的色谱柱(50 mm×4.6 mm)分析收集来的地表水样品中的极性农药,3种未被离线SPE保留的化合物被成功分离分析。陈小龙等[83]采用Poroshell 120 EC-C18核壳型色谱柱,建立了蔬菜、水果中啶酰菌胺、氟啶酰菌胺、环氟菌胺、嘧菌胺、双炔酰菌胺和硅噻菌胺6种新型酰胺类杀菌剂残留量的LC-MS/MS检测方法。该方法简单准确,可满足蔬菜和水果中啶酰菌胺等6种新型酰胺类杀菌剂残留检测的要求。

核壳填料在手性分离中也表现出了明显的优势[84-86]。Lomsadze等[87]用一种多糖手性基团对核壳微球进行修饰,将所制备的手性柱用于反式-均二苯乙烯氧化物、安息香和2,2-二羟基-6,6-二甲基联苯3种物质对映体的拆分。Wu等[88]将二氨基环己烷手性基团键合到核壳微球表面,将所制备的核壳手性柱用于几种外消旋联萘衍生物的快速拆分。与全多孔手性柱相比,核壳手性柱显示出了更高的选择性,具有更高的分离度和理论塔板数。表明核壳型手性固定相在手性分离中具有潜在的优势。

3.2 多肽的快速分离分析

如前所述,核壳填料更适合用于分离生物大分子。Kirkland等[89]采用5 μm薄壳型填料对Br 322 Hea Ⅲ酶解液进行了快速分离,14 min内分离得到18个主要多肽片段。Schuster等[90]利用2.7 μm Halo柱对脱辅肌红蛋白酶解液进行分析,60 min分离得到了216个色谱峰。Min等[46]利用1.9 μm核壳填料在1 min内对5种多肽实现了基线分离。Fekete等[91]采用1.3 μm的核壳填料对蛋白酶解液进行分离,发现当色谱柱长为5 cm时,峰容量随梯度时间的延长由128个增加到178个。当梯度时间固定,峰容量随柱长的增加而增大。故随核壳材料粒径的降低,其分离柱效和分离速度得到极大提高。另外,色谱填料的孔径尺寸也是影响分离效果的主要原因之一,其影响溶质在孔径内的自由扩散。Wagner等[92]研究了核壳填料的孔径尺寸对多肽分离的影响,结果表明孔径9 nm的核壳柱对多肽的分离效果略差,而孔径16和40 nm的核壳柱对多肽具有较好的分离效果,表明分离多肽时需要孔径较大的核壳柱。Kirkland等[93]进一步考察了核壳柱柱长对峰容量的影响,将3支粒径2.7 μm的核壳柱串联起来对蛋白酶解液进行分离,150 min内分离得到了574个组分。Sommella等[94]第一维采用粒径5 μm的C18柱和HPLC,第二维用分别采用粒径1.9 μm全多孔C18柱和1.7 μm的核壳柱及超高压液相色谱仪,构建了在线二维液相色谱法用于过期牛奶中多肽的分离分析。在相同分离时间内,通过比较在不同pH下所获得的峰容量、选择性,结果表明所构建的二维分离模式下的分离效果明显优于一维模式。本课题组[54]将PICA法制备的SiO2@SiO2-C18核壳型色谱柱应用于牛血清白蛋白(BSA)/Hela细胞/小鼠肝脏组织细胞的酶解液的分离鉴定。与全多孔silica-C18毛细管色谱柱分离鉴定的结果相比,采用所制备的SiO2@SiO2-C18核壳型毛细管柱可鉴定出更多的蛋白质和多肽,表明所制备的核壳型色谱柱对蛋白质组学复杂样品中蛋白质和多肽的分离鉴定具有很好的应用价值。

3.3 生物大分子快速分离分析

对生物大分子的分离通常要求填料的孔径大于30 nm。Horvath等[6]早在1967年就指出薄壳型填料能克服全多孔填料在分离生物大分子时传质较差的缺点。核壳型填料为分离生物大分子提供了良好的传质动力。因此,具有大孔径的核壳填料更适合于生物大分子的快速分离分析。

2000年,Kirkland等[89]利用5 μm第二代大孔核壳填料(Poroshell 300)对多肽、蛋白质、核酸、DNA片段等进行了高效分离。与亚-2 μm无孔填料相比,核壳型填料对生物大分子的分离表现出优异的分离性能。Roth等[95]将相同的填料填充到150 mm×75 m的毛细管中,利用LC-MS对Hela细胞酸性提取液中的整体蛋白质进行了分析,基于出色的分离能力和良好的样品负载能力,对复杂基质中的整体蛋白质的检测可达到亚飞摩尔水平。相同的填料还被用于人IgG2二硫键异构酶的通量分析[96]。Staub等[97]比较了2.6～2.7 μm的核壳填料与1.7 μm的全多孔填料对多肽、胰蛋白酶消化液和蛋白质的分离性能,结果表明2.6～2.7 μm的核壳填料对蛋白质和多肽的分离性能与1.7 μm全多孔填料相当。Wan等[53,54]将PICA法制备的孔径为20 nm的核壳微球应用于整体蛋白质的分离分析,在5 min内实现了对6种整体蛋白质的分离分析。Qu等[98]利用双相法制备出较大介孔结构的核壳填料,并应用于蛋白质的快速分离分析,7 min内实现了5种蛋白质的基线分离。Min等[47]进一步降低了材料的粒径,利用1.9 μm的核壳型填料在1 min内实现了5种整体蛋白质的快速分离分析。Gritti等[99]对核壳柱分离生物大分子的传质动力学进行了系统的研究,结果表明填料孔径对相对分子质量较大的蛋白质影响较大。Wagner等[100]系统地研究了粒径大小、孔大小、壳层厚度及键合相对生物大分子分离的影响。通过调节微粒的性质,可以制备出不同孔径的核壳微球,以满足不同相对分子质量物质分离的要求。大孔的核壳柱还被用于治疗蛋白质的快速分析[101,102]。Halo Protein柱(粒径3.4 μm,壳厚度200 nm,孔径40 nm)被用于分析IgG及其片段[103,104]和分析抗体药物偶联物[105]。

4 展望

核壳型色谱填料作为全多孔硅胶填料真正的替代品,以其高效、快速和低背压的优良色谱性能获得广泛关注,在复杂样品的快速分离分析中已得到了应用。未来核壳填料的发展将集中在以下几个方面:(1)壳层厚度可控、孔径可调、形貌均一的二氧化硅核壳微球新的制备方法的研发。该方法操作简单,成本低,易于放大,特别是适用于生物大分子快速分离分析的具有放射性大孔的核壳微球的制备。(2)采用不同的分离模式,如反相、正相、亲水、离子交换色谱等,进一步扩展二氧化硅核壳微球新的应用领域。(3)二氧化硅微球的壳层厚度、孔径、粒径、化学稳定性、表面改性等对小分子和生物大分子快速分离的影响及优化。(4)与核壳柱配套使用的HPLC系统,以保证二氧化硅核壳色谱柱对复杂样品快速分离分析时能获得最佳的选择性、灵敏度和柱效。