荧光定量PCR仪计量校准结果的影响因素分析及控制

梁文 罗超 盛舒瑶/上海市计量测试技术研究院

0 引言

根据国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》[1]，实时荧光RTPCR检测被列为确诊病例的两种方法之一，该方法由于检测时间短、成本低等特点[2]，已成为应用最广的确诊新型冠状病毒的方法。用实时荧光RTPCR法进行疑似病例确诊需要检测到患者体内含有新型冠状病毒的特征基因，而特征基因的检测有两个重要的制约性条件：一是新型冠状病毒核酸检测试剂盒，二是检测结果准确可靠的荧光定量PCR仪（以下简称PCR仪）。为确保PCR仪检测结果的准确可靠，2015年发布了JJF 1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》[3]。上海市计量测试技术研究院是全国最早开展PCR仪计量校准的单位之一，根据多年的经验积累，现就荧光定量PCR仪校准过程的影响因素进行探讨。

1 温度部分校准的影响因素

温度检测计量器具通常由15个精密温度传感器、数据采集分析模块组成，测温范围为0～120 ℃，测量不确定度U=0.10℃（k=2）。该装置可实现静态温度测定、动态温度跟踪和多通路检测，每个探头的实时采集数据以曲线图格式保存在磁盘中，并通过软件解码处理[4]。该装置用于对PCR仪的温度示值误差、温度均匀度、平均升降温速率、样本示值误差等温度指标进行校准。

温度探头贴合性的影响：测温探头的外观应该和PCR反应孔的外观一致，尺寸误差小于1 mm。市场上在售PCR仪的厂家和型号众多，虽然反应孔的大小有行业的统一规定，但反应孔的高低有0.1 mL和0.2 mL两种不同的型号。不同厂家，甚至同一个厂家不同型号的仪器有不同的样品仓打开方式，都会对测温探头的贴合性提出新的挑战。仪器校准实施单位购买0.1 mL反应孔适用的测温探头，当检测0.2 mL反应孔时，应在测温探头固定板上加盖同等大小、高度适合的软木塞，以便测温探头和反应孔底部充分接触。旋转式样品仓打开方式的仪器（如ABI公司的Quanstudio 12K），宜先将测温探头平稳地放入仪器内，再开启仪器进行测温。避免开启仪器后，将测温探头放入样品托盘，旋转进入样品仓。因为旋转的过程不可控，易导致探头和反应孔对标不准，测温探头和仪器反应孔贴合性差导致测温不准，严重情况可导致测温探头支撑板折断。

2 核酸检测部分校准的影响因素

核酸定量检测准确性的校准采用国家有证标准物质，要求相对扩展不确定度小于5%。将标准物质经系列稀释后配制成浓度范围为 102～1010copies/μL的样品，作为DNA模板配制PCR反应体系，制备PCR仪校准板，对定量PCR仪的样本示值误差、样本线性等定量指标进行校准。

2.1 核酸反应试剂耗材的配套性影响

PCR反应管/反应板的配套性：不同型号仪器，除了有特定的0.1 mL或0.2 mL的容积的差别外，反应盖帽也有差异。例如：罗氏公司与ABI公司的反应罐不同，部分国产公司的PCR仪盖帽有明显的弧度，不能良好配套可能导致PCR管盖帽多余部分被105 ℃高温的PCR仪热盖熔化。

PCR预混液中ROX校准荧光剂的添加对定量结果准确性的影响：由于不同厂家的仪器对预混液的选择性不同，对同一台仪器使用不同的PCR预混液得到的校准结果会有差异。如TAKARA公司生产的PCR预混液带有两种ROX校准荧光剂，本实验室前期的工作经验显示罗氏公司的仪器可以不使用ROX校准荧光剂，而ABI公司的仪器不使用ROX校准荧光剂会使实验的重复性变差。

2.2 校准用标准物质的影响

标准物质的均匀性、稳定性、定值的可靠性直接影响核酸定量检测的结果。大分子核酸和小分子的化学试剂不同，容易出现分散性差、易聚集的问题[5]，因此取样稀释时标准物质的均匀性会影响定量结果的准确性。另外生物标准物质稳定性受温度影响较大，保存时间较短或容易受到运输条件和反复冻融的影响，导致部分降解量值不准确[6]。采用上海市计量测试技术研究院研制的国家二级标准物质阪崎肠杆菌ITS基因检测质粒DNA标准物质GBW(E)100307，该标准物质浓度为 75.1 ng/μL，2.2×1010copies/μL，相对扩展不确定度Urel=2.8%（k= 2）。

2.3 标准物质系列溶液配制的影响

稀释操作的影响 ：应严格按照 JJF 1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》的要求，用经过计量检定合格的电子天平进行称量和稀释，而不应该直接采用移液器进行稀释，移液器稀释会大大增加核酸定量结果的不确定度。稀释的过程中尽量采用10倍稀释，不能采用1 000倍稀释[7]。

稀释缓冲液的影响：试验发现，稀释缓冲液对核酸标准物质的稳定性影响很大，特别是对于低浓度的核酸样品。本实验室分别用灭菌水和TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH=7.5）稀释得到浓度为 440 000 copies/μL（样品 1）和 220 000 copies/μL（样品 2）标准溶液，在室温分别放置 4 h、8 h、24 h 后，用荧光PCR仪检测这两种浓度的标准溶液的Ct值（扩增循环数），数据见表1，结果显示用灭菌水进行稀释的标准溶液的Ct值有明显的滞后现象，建议采用TE缓冲液进行稀释。

表1 不同稀释方式对核酸浓度的影响

2.4 PCR反应体系配制的影响

市场上在售的PCR仪以96孔的居多，给96个反应孔加液对操作人员加样准确性和重复性有较高的要求，不当操作会影响校准结果的准确性。建议操作时有条件的话尽量使用排枪加样，减少单孔加样的误操作。反应体系中DNA的体积占总体积的20%最佳，既避免DNA干扰物对实验的抑制作用，又避免DNA溶液加样量过少带来的误差。分两步加样，先统一加入除DNA外的反应液成分，再加入不同浓度的核酸标准物质和未知样品。建议操作不熟练的校准员，使用配制好并经计量验证的PCR校准反应板。

3 结语

综上所述，开展荧光定量PCR仪校准时，即使按照规程规范操作，每个校准环节中的影响因素也可能带来误差，校准人员应当对校准过程增加了解、熟悉操作，使校准结果更加准确可靠。当前各校准机构都在积极投入疫情防控技术服务的工作，相信通过行业齐心协力，开展有效的经验分享和问题探讨，提升工作效率和质量，就能让仪器更加精准、数据更加可靠、质量控制更好，为各检验机构更加快速地实现新型冠状病毒的确认和打赢疫情防控阻击战作出计量人的贡献。