降低样品采集制备过程中土壤硝态氮和铵态氮测定误差的方法

朱靖蓉，马 磊，康 露，杨 涛，李 磐，蒲胜海，马兴旺

(1.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，乌鲁木齐 830091；2.农业农村部西北绿洲农业环境重点实验室,乌鲁木齐 830091；3农业部农产品质量安全风险评估实验室(乌鲁木齐),乌鲁木齐 830091；4.新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

1 材料与方法

1.1 材 料

收集、整理相关文献资料。

1.2 方 法

以追踪主题词相关内容踪迹变化方法和统计方法分析文献。

2 结果与分析

2.1 现行土壤硝态氮和铵态氮测定方法中易引起误差的环节

2.1.1 实验室测定步骤有严格误差控制

土壤硝态氮、铵态氮含量测定常用方法有，在碱性介质中还原为氨后的蒸馏法或微量扩散法，在酸性介质显色的酚二磺酸比色法等手工测定方法；以及仪器分析方法，如紫外分光光度法、硝酸离子选择电极法、极谱法、离子色谱法、气相色谱法、毛细管电泳分析法以及流动注射分析法[4,5,14-17]。酚二磺酸比色法和靛酚蓝比色法是土壤硝态氮、铵态氮含量测定的常规方法[4,5,18,19]，土壤硝态氮测定的国家标准方法是紫外分光光度法[20]，流动注射分析法的使用越来越普遍[12,21～27]。

实验室测定土壤硝态氮、铵态氮的方法，无论是化学测定方法还是仪器分析方法，在实验室进行的试剂配制、土壤样品称量、振荡浸提、化学测定或仪器分析等过程和环节都有严格的规定，尽管不同方法中的浸提剂和浸提液中硝态氮、铵态氮浓度测定方法不同，但测定数据都有严格的误差控制，数据之间有相关性。

2.1.2 土壤样品采集和制备环节易引起测定数据误差

上述方法均要求“采用新鲜土壤样品”进行浸提，但对细节的描述不够细致，操作性不强。比如，农业行业标准NY/T 1121.1-2006“土壤检测-第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存”对新鲜土壤样品的制备给出的规定是“为了能真实地反映土壤在田间自然状态下的某些理化性状，新鲜样品要及时送回室内进行处理分析，用粗玻璃棒或塑料棒将样品混匀后迅速称样测定。新鲜样品一般不宜贮存，如需要暂时贮存，可将新鲜样品装入塑料袋，扎紧袋口，放在冰箱冷藏室或进行速冻保存”[28]。国家标准GB/T 32737-2016“土壤硝态氮的测定 紫外分光光度法”的规定更明确了，要求新鲜土壤“样品采集后应于4℃下运输和保存，并在3 d内分析完毕。否则，应于-20℃(深度冷冻)下保存，样品中硝酸盐氮和氨氮可以保存数周。当测定深度冷冻的硝酸盐氮和氨氮含量时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h 内完成样品解冻、匀质化和提取；如果在4℃下解冻，解冻时间不应超过48 h”[20]。国际上大多也是用新鲜土壤样品分析无机氮，对样品前处理的细节描述也不尽详细[1-3]。可见样品前处理，即新鲜土壤样品的采集和制备环节步骤描述比较笼统很容易引起测定数据误差。

实践中，经常会遇到采样点距实验室远、同一批次采样数量大、采样人员和设备不富裕等具体问题，造成按标准制备新鲜土样有难度，况且该标准的规定本身弹性就大，不同研究者在新鲜土壤样品的采集和制备过程中必然会出现操作差异，即使同一操作者制备的同一批样品其制备条件也会有差异，必然会影响硝态氮、铵态氮测定结果的准确性和可比性。为了避免客观条件造成的测定误差过大，必须了解影响误差的操作环节和原因。

2.2 土样采集和保存过程对土壤硝态氮和铵态氮测定结果的影响

田间采样时可能出现的情况有：采样数量大，同一批样品采集时间长；样品不能及时送往实验室，在田间放置时间长；样品从田间送到实验室的路途遥远等情况。随之产生的关键问题在于采集的新鲜土样在室外放置，一定时间后测定的土壤硝态氮和铵态氮含量与采集时含量有多大差别。

2.2.1 土壤样品采集后放置在室外会引起土壤硝态氮含量增加

几十年前就已经发现土壤样品采集后放置在室外会引起土壤硝态氮含量增加。有研究结果表明，新鲜土样采集后密封保存在聚乙烯袋内，20℃下保存48 h硝态氮含量有轻微的变化，变化幅度在-1～1.6 mg/kg，保存超过48小时后硝态氮含量通常都增加，保存14 d后增加6～39 mg/kg[29]。用美国的石灰性土壤，以新鲜土壤样在采集2小时后立即浸提的测定值为对照，新鲜土样密封在塑料袋内在室外放置以模拟样品从田间带回室内的情景(每天有7 h日照，气温经常会超过40℃)，24 h后不同肥力土壤硝态氮含量的增加量在2.85～6.83 mg/kg，48 h后在5.54～12.99 mg/kg，7 d后在19.6～36.4 mg/kg，而且肥力越高的土壤硝态氮含量增加越多；密封放置在22℃室内的土壤硝态氮含量24 h会增加3.64～6.16 mg/kg，48 h后增加6.88～11.70 mg/kg，7 d后增加18.2～27.5 mg/kg[30]。

2.2.2 土样低温运输也会引起引起土壤硝态氮和铵态氮含量变化

即使按照广泛推荐并应用的方法[1,11,20,30]，采集的新鲜土壤样品放在4℃的冷藏箱里运输，这也不能完全避免土壤硝态氮和铵态氮含量的变化。Westfall把新鲜土样放在4℃的冷藏箱中，土壤硝态氮含量24 h会增加1.18～3.27 mg/kg，48 h后增加2.29～6.04 mg/kg[30]。Ishaq A. Mian[31]发现即使采集的新鲜土壤样品放在2～4℃冷藏，16 h后土壤硝态氮含量也比刚从田间采集时有明显的增加，铵态氮含量降低，无机氮总量增加；当然不同肥力土壤中的硝态氮和铵态氮含量变化幅度不同。苏涛[32]用陕西不同作物茬口土壤，分析冷藏土壤与鲜土样硝态氮、铵态氮含量差值，认为随冷藏时间延长土壤硝态氮、铵态氮含量较鲜土样增加，且不同茬口土壤增加幅度不同。但杨乐苏[33,34]用热带雨林土壤、高飞用北京耕地土壤，分析冷藏土样硝态氮、铵态氮含量与鲜土样含量的相对误差，认为土样在4℃冷藏后与鲜土样硝态氮、铵态氮含量差异在可接受范围。

可见，采集的新鲜土样密封包装后，无论是暴露在空气中还是在冷藏箱里，一定时间后土壤硝态氮和铵态氮含量都会升高。土壤湿度和温度是控制氮循环的两个最重要的非生物因素[35]，硝态氮、铵态氮在土壤中的转化始终在进行，土壤湿度、气温和田间放置时间等因素的综合作用，会使土壤氮发生复杂的形态转化，会进一步导致同一批样品测定的硝态氮、铵态氮结果偏离“真值”、增大平行误差。相对与暴露在室外环境下运输，土样放在冷藏箱里运输时土壤硝态氮、铵态氮含量的变化要小的多。因此采集的新鲜土壤样品应该放在4℃的冷藏箱里2 h内送回实验室进行处理，这可以最大程度减小误差；即使存在采样时间长、路途遥远等客观限制，新鲜土样应该以最快速度送回实验室进行处理。

2.3 土样的处理保存过程的影响

很多情况下受实验室条件限制，采回的土样不能立即浸提、测定，土样要保存一段时间，而冷藏、冷冻、风干或烘干等不同的保存方式及保存时间长短会对硝态氮、铵态氮测定结果有不同的影响。

2.3.1 新鲜土样、风干土样和烘干土样的测定结果差异较大

土壤矿质氮含量的变化主要是生物活动引起的，与土壤水分有很大关系，土壤水分含量高于萎蔫点硝化反应就会发生，氨化反应在低于萎蔫点就可以发生[36]。从降低土壤含水量，减弱或阻止土壤中氮含量变化方面有不少工作。

大多数研究的结果是,新鲜土壤风干后测定的硝态氮和铵态氮含量会增加。Nelson用pH5.5～7.8的10种土壤，新鲜土壤样被迅速带回实验室后在22℃室温下风干72 h后，土壤硝态氮和铵态氮分别平均增加1.7和4.2 mg/kg，风干土样在室温下密封保存1个月无机氮增加幅度不大，但随后会缓慢增加[37]。朱靖蓉[27]选取新疆不同肥力的石灰性土壤灰漠土，风干土硝态氮、铵态氮含量明显高于新鲜土含量。赵瑞芬[22]用山西大棚菜地土壤研究表明新鲜土经风干后土壤硝态氮和铵态氮含量有显著增加。Ma等选取ph5.8～7.5的8种不同质地和肥力的土壤，新鲜土样在2 h内浸提测定，同时新鲜土样在22℃的室内风干24 h后密封保存在室内2个月，土壤硝态氮、铵态氮和无机氮含量均明显增加，铵态氮比硝态氮增加的多，但是风干土与新鲜土样测定结果之间有很好的相关性，可以用风干土测定结果估计新鲜土样的无机氮含量，尤其是推断硝态氮含量效果很好[11]。

也有研究显示风干土硝态氮和铵态氮含量与新鲜土壤的相差不显著或降低。宋建国[38]选取北方19种不同肥力土壤，新鲜土、风干土和烘干土之间土壤硝态氮、铵态氮数量差异不显著，土壤铵态氮数量有所增加。孟盈用热带雨林土壤，新鲜土和风干土硝态氮、铵态氮含量差异不显著，新鲜土和风干土硝态氮、铵态氮含量均显著高于烘干土[39]；Ke-yi Li在春季和秋季采集陕西的10个土样，风干土中的硝态氮含量较之于新鲜土平均减少了4.9%，铵态氮增加了30.0%[12]。

土壤烘干后硝态氮和铵态氮含量一般比风干土高，比新鲜土更高。Nelson用pH 5.5～7.8的10种土壤，新鲜土壤样被迅速带回实验室在55℃烘干16 h，土壤硝态氮和铵态氮分别平均增加1.0和5.1 mg/kg[37]。赵瑞芬用山西大棚菜地土壤，新鲜土经烘干后土壤硝态氮、铵态氮和铵态氮含量有显著增加，新鲜土<风干土<烘干土[22]。Ma等选取ph5.8～7.5的8种不同质地和肥力的土壤，新鲜土样在2 h内浸提测定，同时新鲜土样分别在20和40℃下通风干燥24 h，密封后在室温22℃下放置2个月，土壤硝态氮和铵态氮均比新鲜土壤提高，两种干燥温度下的差别不大，但40℃烘干土的硝态氮和铵态氮含量更高[11]。

自然条件下土壤干湿交替是一种普遍现象，其作用往往会加速土壤氮素矿化过程[40]，鲜土样经过风干后会引起土壤理化性质变化，土壤在干燥过程中温度对土壤无机态氮的数量会有较大的影响[41]，土壤易矿化有机态氮的数量因处理温度的不同而有较大差异[42]。不同土壤的性质导致结果不同，大批量样品时烘干的工作量大不容易实现，风干能保存时间较长，但要得到风干土与新鲜土中硝态氮和铵态氮之间的相关关系是不容易的。因此以风干或烘干土壤的土壤硝态氮和铵态氮反映采样时状态不可行。

2.3.2 不同温度冷冻保存后测定结果有差异

大多数研究表明新鲜土壤冷冻保存后硝态氮和铵态氮含量变化较小。Nelson用pH5.5-7.8的10种土壤，被迅速带回实验室的新鲜土壤样在-5℃冷冻48 h后，土壤硝态氮和铵态氮平均分别增加0.4和0 mg/kg，保存9个月后也只增加了0.8和0.1 mg/kg，他认为只要冷冻前迅速处理，冷冻时放在密封袋里，融化时间足够短，-5℃冷冻保存不会引起明显的硝态氮和铵态氮含量变化[37]。杨乐苏把热带雨林土壤在-6～-7℃冷冻保存，发现冷冻后土壤硝态氮、铵态氮含量与新鲜土样含量相对误差较小[33]。于天仁[43]发现在-15℃保存土样硝态氮、铵态氮变化很小。Ma等选取ph5.8～7.5的8种不同质地和肥力的土壤，新鲜土样在2 h内浸提测定，同时新鲜土壤密封后保存在-15℃，2个月后在室温下4 h内解冻浸提测定，土壤硝态氮含量有明显的增加，而铵态氮含量在几种土壤中有增加也有降低[11]。但高飞和朱强用华北地区土壤发现-18℃冷冻后土壤硝态氮、铵态氮含量较鲜土样增加38～262%，且不同土壤增加幅度不同[34,26]。土样冷藏或冷冻主要是通过降低温度使土壤中微生物生长速率和酶活性降低，从而减少土壤中氮形态间转化，以降低硝态氮、铵态氮测定结果的差异。不同研究者的实验条件和土壤肥力状况不同，冷冻后土壤硝态氮和铵态氮含量变化的趋势不尽相同，但大多数的结果说明新鲜土壤不能及时浸提测定时，冷冻保存是减少误差的较好方法[27]，保存时间也不能太长，1个月内测定变化不显著，尽可能在3个月内测定。

冷冻土壤的融化方式和时间对土壤中硝态氮和铵态氮含量有影响。M. J. Esala把质地和肥力不同土壤进行自然融化、研磨等，发现自然融化的方式导致的土壤硝态氮和铵态氮含量变化最小；在4℃以下融化时，4 h内不会导致土壤硝态氮和铵态氮含量的明显变化，4～8 h就会有略微的增加[44]。所以冷冻土壤的土块不要太大，尽可能在4℃以下4 h内化冻，使土壤达到均质化可以浸提的状态。

2.4 土壤浸提过程对土壤硝态氮和铵态氮测定结果的影响

2.4.1 浸提剂和浸提时间长短不同时测定结果差异明显

很多盐可作为溶解性无机氮浸提剂，不同的浸提剂对土壤硝态氮、铵态氮测定结果有明显的影响。王红萍[45]认为2 mol/L KCl溶液、饱和CaSO4溶液、0.01 mol/L CaCl2溶液和去离子水浸提硝态氮无明显差别，而浸提铵态氮差别明显。朱强提出浸提潮土、黄棕壤及棕壤中的硝态氮、铵态氮时，0.01 mol/L CaCl2和2 mol/L KCl两种浸提剂测定结果的相关性达到P<0.01 水平[26]。Houba[46]详细综述了0.01 mol/L CaCl2溶液在土壤养分测定的方法，它具有组成简单、配制方便、易获得澄清滤液、离子强度与土壤溶液相近等优点。Ke-yi Li提出0.01 mol/L CaCl2特别适合大批量样品的浸提[12]。所以越来越多的文献采用0.01 mol/L CaCl2溶液做浸提剂[47,48]。林业行业标准LY/T1228-2015规定酚二磺酸比色法测定土壤硝态氮用饱和硫酸钙溶液浸提，靛酚蓝比色法测定土壤铵态氮用2 mol/L KCl溶液浸提，连续流动注射分析仪法测定土壤硝态氮、铵态氮含量一般采用2 mol/L KCl溶液浸提[15]。国标GB/T32737-2016规定紫外分光光度法测定土壤硝态氮用1mol/L KCl溶液浸提[20]。

振荡浸提时间对土壤硝态氮、铵态氮测定结果有影响。大多数文献提到浸提硝态氮、铵态氮时振荡时间为60 min。Ke-yi Li提出震荡60 min就足够了[12]。但有研究认为振荡浸提30～60 min时，硝态氮和铵态氮的测定值相对稳定，测定的硝态氮、铵态氮浓度再没有大差别，可以认为振荡30 min时已能基本浸提出土壤中硝态氮和铵态氮，因此振荡30 min即可[27]。

2.4.2 浸提液保存方式引起测定结果差异

浸提液保存方式对硝态氮、铵态氮测定结果有明显影响。Ke-yi Li在春季和秋季采集陕西的10个土样，较之于浸提后立刻测定的数值，浸提液在-18、4和25℃保存下，随着时间延长，测定值会增加，即使保存2周测定值也有明显增加，相对的，-18℃保存的浸提液测定值增加的较小[12]。高飞提出浸提液以常温、冷藏和冷冻形式保存，7 d内硝态氮、铵态氮测定结果没有显著差异[34]。朱强提到浸提液在4℃和常温下保存，短时间内两者的硝态氮、铵态氮测定值没有差别，但保存时间长则测定的硝态氮、铵态氮浓度会明显增加；冷冻保存的浸提液测定的硝态氮、铵态氮浓度随着土壤类型不同，有上升或下降的趋势，大部分是升高[26]。可见浸提液在不同温度保存时，也会引起硝态氮、铵态氮测定结果的不同。如果要积累大批量样品进行批次测定，就必须考虑合适的浸提液保存方式。冷冻保存是比较好的方法。

3 讨 论

3.1 要想室内测定得到采样时田间状态下的准确的土壤硝态氮和铵态氮含量是不可能的

土壤中无数的微生物和酶主导着氮的矿化和固定[49]，微生物生物量氮的活性及其消长被认为是土壤氮素内循环的本质性内容[50]，只要土壤湿度、温度这些外部因素合适，土壤中氮不同形态间就进行转化[35,36]。从操作实际看，无论是在土壤样品采集运输或实验室保存，冷藏甚至冷冻也不能有效的阻止土壤中氮形态的转化[30,51]，只是硝态氮和铵态氮含量变化的程度取决于土壤类型、肥力等。在土壤采样、运输、保存等前处理过程中，想要完全阻止土壤中氮形态间的转化是不可能的，或者说想绝对的得到采样时土壤硝态氮和铵态氮含量数据基本不可能。

3.2 改进前处理措施降低土壤硝态氮和铵态氮测定值与真实值之间的误差是可能的

在土壤样品采集、运输、保存等环节，如果土壤温度、湿度不能有效控制，会使测得的土壤硝态氮和铵态氮含量远远偏离采样时的含量；但是如果把温度、湿度以合适的方法控制在适当的范围内，测得的土壤硝态氮和铵态氮含量会较小偏离采样时的含量，甚至与采样时的含量差异不显著。关键是采用适当的土壤前处理和浸提液保存措施。

3.3 要建立一套适合各种气候条件和土壤类型的通用的土壤前处理方法是有困难的

无论是不同的人采用低温冷藏、常温保存、低于零度的冷冻、风干、烘干等同一措施对不同的土壤研究，还是同一个人采用同一措施对不同土壤开展研究，同一措施在不同地方、不同肥力土壤的实验结果不尽相同。说明了土壤中氮素转化的复杂性，也说明为了减少或降低土壤前处理对土壤硝态氮和铵态氮测定的影响，应该在坚持原则一致的情况下，各地因地制宜制定土壤前处理改进措施。

4 结 论

4.1 降低新鲜土壤硝态氮和铵态氮含量测定值与真值间误差的关键，是加快采样、样品储运、浸提的速度，至少要严格遵照国家标准GB/T 32737-2016“土壤硝态氮的测定 紫外分光光度法”规定的时间要求。

4.2 采取以下土样采集和制备方法可以使新鲜土壤硝态氮和铵态氮含量测定值与真值间误差最小：田间采样时土壤样品密封后立刻放入4℃以下冷藏箱；2 h之内样品冷藏送回实验室进行浸提，否则-20℃保存土样；冷冻时以小份、小块保存，在3个月内测定完毕；冷冻样品解冻尽可能在4 h内完成，使土壤达到均质化可以称量的状态；快速取样、浸提，振荡0.5 h到1小时即可；浸提液在4℃以下保存，2 h内测定完毕，否则浸提液在-20℃下冷冻保存。