1株新疆胡杨林昆虫病原线虫鉴定及生物学特性

詹发强, 侯 敏, 杨 蓉, 王 宁, 包慧芳, 侯新强, 崔卫东, 龙宣杞

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物重点实验室 ，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】 昆虫病原线虫是一种专性寄生昆虫并且体内携带有共生细菌的体型微小的线虫[1-2]。昆虫病原线虫作为1种新型生物杀虫剂，在国内外农林害虫生物防治领域日益受到重视，国内外在分类鉴定，以及园艺、蔬菜、经济作物等各类作物上开展了以昆虫病原线虫为主的生物防治害虫研究和应用，目前为止已有许多利用昆虫病原线虫防治地下害虫成功的报道[3-14]。昆虫病原线虫具有较强的地域性，分类收集该地区昆虫病原线虫并能够应用可规避潜在生物风险及提高防控效率。世界上的胡杨绝大部分生长在中国，而中国90%以上的胡杨又生长在新疆塔里木河流域，胡杨生长的地域环境相对恶劣，甚至极端恶劣，在这样环境中蕴藏的昆虫病原线虫资源必定有其独特的分布类群和适应机制，对于胡杨林虫害的生态动态控制具有重要作用。 研究分离筛选新疆巴楚胡杨林中的昆虫病原线虫及其共生细菌为应用于天然胡杨林中害虫的生物防治提供依据。【前人研究进展】目前我国在黑龙江、甘肃、云南、河北、广东等已报道的昆虫病原线虫斯氏线虫科和异小杆线虫科的线虫共计40 多个品系，200 多种[15]。Steinernemalitorale昆虫病原线虫是2004年在日本[16]发现并被鉴定为新种，截至目前在巴基斯坦[17]发现(Steinernemalitoralestrain Pak.P.s.7)并描述了这个种，中国河南、山西和辽宁等地区也有分布[18-19]。随后，针对不同地域分离的Steinernemalitorale开展了杀虫、共生细菌分离鉴定、耐冷等生物学特性分析研究，其中研究发现，海滨斯氏线虫具有侵染力强和耐干燥力特性[20]，哈尔滨当地海滨斯氏线虫经低温驯化能显著提高其适低温特性，并能用于后期长期贮存[21]。【本研究切入点】但至今关于这个种的线虫的研究工作还比较有限，由于分离获得的品系还较少，开展系统分类鉴定和生学学特性分析的相关研究更少。研究1株新疆胡杨林昆虫病原线虫鉴定及生物学特性。【拟解决的关键问题】在我国新疆巴楚天然胡杨林土壤中分离获得1株昆虫病原线虫，研究和验证其种属分类关系，测试其杀虫活力，为开展其系统生物学特性，以及新疆天然胡杨林昆虫病原线虫分布特征和其对胡杨林害虫的生物防治研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤样品及诱导虫来源

分离昆虫病原线虫的土样来自新疆喀什地区巴楚县夏马勒林场天然胡杨林，采集时间为4月下旬，采集土壤样品时，清理开胡杨叶层后，随机取10～15 cm 深的5个点为1个土样，在近2 km2的范围内共采集土样共24份，采集土样每份样品单独消洗采样器，采集的土样装在密封袋内且不高于20℃条件下保存，运回实验室后第1时间进行后续诱导处理；大蜡螟幼虫为诱导虫，其由实验室传代培养及扩繁获得；黄粉虫幼虫(Tenebriomolitor)购自新疆明珠花卉市场。

1.1.2 主要仪器、试剂与培养基

MSSPX-250 型生化培养箱，MLS-3020 高压蒸汽灭菌锅，SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台，eppendorf 5418R 离心机，PCR 仪 Eppendorf No:5345，电泳仪 Bio-Rad Mode 200/2.0，凝胶成像仪 United-Bio，GK-330C plus，Olympus CX41 相差显微镜，奥林巴斯 SZ61 体式显微镜， PCR 预混液(TaKaRa Biotechnology)。

细菌基因组提取试剂盒，其余试剂均为分析纯。试剂有硫柳汞钠，溴百里酚蓝，氯化三苯四唑，PCR 预混液(TaKaRa Biotechnology) 等，其余试剂均为分析纯。

NBTA培养基[22]， NA固体与NB液体培养基成品购买自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 方 法

1.2.1 昆虫病原线虫的分离及形态学鉴定

昆虫病原线虫的诱导采用White-trap 法。昆虫病原线虫永久性样本的制备参考Khuong B. Nguyen[23]《昆虫病原线虫系统学与共生细菌系统发育》书中关于形态学鉴定的流程和步骤；用OLympus CX41相差显微镜进行形态特征测量。

1.2.2 昆虫病原线虫共生菌的分离

用收集到的侵染期线虫以每头大蜡螟幼虫约100条剂量自然侵染，于9 cm培养皿内铺双层滤纸，加入1.5 mL的线虫悬浮液，再放入7头大蜡螟幼虫，置于25℃避光培养，待大蜡螟幼虫死亡后及时开始分离共生细菌[22]。

1.2.3 昆虫病原线虫18S rDNA及共生细菌16S rDNA扩增鉴定

DNA 提取及序列扩增[22]：线虫总 DNA 提取及18S rDNA扩增：18S：5’-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3’ ，26S：5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’，PCR反应体系为50 μL，含有24 μL premixTaq，引物各1 μL，模板2 μL，无菌水22 μL。扩增条件：94℃，4 min；94℃，1 min；53℃，45 s；72℃，90 s；30X；72℃，7 min。共生细菌总 DNA 提取及16S rDNA扩增：27F：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′； 1492R：5′-CAAACTTGGTCATTAGAGGA-3′。PCR扩增反应体系为50 μL，含有24 μL premixTaq，引物各11 μL，模板2 μL，无菌水22 μL。扩增条件： 94℃， 4 min， 94℃ ，55 s，53℃， 30 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃ 7 min。

1.2.4 序列测定及进化树构建

PCR扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，PCR产物直接进行双向测序，引物合成及序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。将测序得到的18S rDNA 和16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的18S rDNA和16S rDNA序列，用Clustal X软件和MEGA 4.1中Neighbor-joining法构建其系统进化树，初步确定其分类地位。

1.2.5 侵染力测定

侵染力测定采用不同剂量分别对2种幼虫(大蜡螟幼虫和黄粉虫幼虫)开展测试，实验设7 个剂量处理：10、20、40、80、160和320和640 IJs/幼虫；在9 cm 的培养皿垫2 层滤纸，放置10 条活泼健壮、大小基本一致的供试虫，总加水量1.5 mL/皿；对照加等量清水，每处理和对照各3 次重复，封口膜封口，置于25℃、70% RH 的恒温培养箱内，每12 h 观察统计1次，直至某处理的死亡率达100%或对照组的死亡率达20%，计算校正死亡率。

1.3 数据处理

Excel 2007数据整理统计。

2 结果与分析

2.1 昆虫病原线虫的诱导和收集

在新疆巴楚县夏马勒林场天然胡杨林中采集的24份土壤样品中，从6份土样中分离获得昆虫病原线虫，检出率达到25%；研究表明，在干旱少雨的巴楚天然胡杨林土壤中有昆虫病原线虫存在，且检出率较高。线虫侵染大蜡螟后1～2 d致大蜡螟幼虫行动迟缓，2～3 d致死，致死后大蜡螟虫体变软，虫体上伴随有细小的黑斑出现，体色逐渐变深，从致死大蜡螟幼虫到大量侵染期幼虫出现在收集盘内需要10～12 d，在室温(约25℃)条件下侵染期线虫在水中运动缓慢，且大多数侵染期线虫处于静止状态，用挑针轻微拨动，随即开始运动，一段时间后又恢复静止状态。所获6个样品的昆虫病原线虫对大蜡螟的侵染后的表型特征以及侵染期线虫在水中的少数移动、多数静止的模式基本一致。图1

图1 大蜡螟幼虫被S.litorale-Bachu 侵染效果

Fig.1 The Gm larvae in different stages infected byS.litorale-Bachu

2.2 昆虫病原线虫及其共生细菌分子系统发育

将全部6个分离到的昆虫病原线虫提取基因组、18S rDNA扩增、测序和比对，6株线虫18S rDNA序列完全一致，18S rDNA系统发育树分析表明，在进化关系上与Steinernemalitoralestrain Pak.S.P.7 JF892546.1进化关系最近，相似度较高，与模式株SteinernemalitoraleAB243441.1处于同一分类大支；分离获得的线虫命名为SteinernemalitoralestrainPopluseuphratica-1 XJ Bachu简写为(S.litorale-Bachu )，通过序列提交至Genebank获得基因登录号 No: MK416208。S.litorale-Bachu 在新疆巴楚夏马勒林场天然胡杨林土壤中是优势昆虫病原线虫种群。图2

图 2 S.litorale -Bachu 18S rDNA进化树

Fig. 2 18S rDNA cladogram ofS.litorale-Bachu . Bar 0.5% sequence divergence

将全部6个样品的昆虫病原线虫共生细菌分离和提取基因组，16S rDNA扩增、测序和比对后，6株共生细菌16S rDNA序列也完全一致，更进一步验证了线虫为同一类。进化树分析表明，从被S.litorale- Bachu侵染大蜡螟后的血腔液中分离的共生细菌属于Xenorhabdusbovienii种，与Xenorhabdusbovieniistrain Zakharovo 的进化距离最近，这也与前人关于这个种的昆虫病原线虫共生细菌描述一致[17]。图3

图 3S.litorale- Bachu 共生细菌16S rDNA进化树

Fig. 3 16S rDNA cladogram of symbiotic bacteria ofS.litorale- Bachu . Bar 0.2% sequence divergence.

2.3 昆虫病原线虫形态学测量及对比

测量S.litorale-Bachu第1代雄虫与侵染期幼虫的形态学特征，其与已报道的斯氏线虫属线虫Steinernemalitorale模式株在第1代雄虫和雌虫，以及侵染期幼虫在形态特征值大部分吻合，但在第1代雄虫形态特征对比上较模式株有以下不同：体长略长(1 461.01 μm)、排泄孔至头部距离短(86.98 μm)、交合刺短(69.49 μm)、D%(60.45)与SW%158.21 值均小于模式株；侵染期幼虫形态特征值有以下不同：体长(885.88 μm)和尾长(74.81 μm)短、E%(83.88)值大于模式株；第1代雌虫形态特征值有以下不同：体长4 608.76 μm、排泄孔至头部距离(99.44 μm)、尾长(55.36 μm)和D%(54.08 )值均大于模式株。通过测量对比分析，S.litorale-Bachu无论是第1代雄虫和雌虫，还是侵染期幼虫各项特征指标均与Steinernemalitorale模式株较为相近，与steinernemafeltiae不同生长期线虫的特征指标差异较大，从新疆巴楚县胡杨林分离得到的线虫属于Steinernemalitorale种。表1，图4，图5

注：a：全长；b：头部；c：尾部

Note:a:Infective juveniles; b: Head; c: Tail

图4S.litorale-Bachu 侵染期幼虫不同部位显微

Fig. 4 Micrograph of IJs different parts ofS.litorale-Bachu

注：a：全长；b：尾部和交合刺；c：头部

Note:a: Male; b: Tail and Spicule; c: Head

图5S.litorale-Bachu 雄虫不同部位显微图

Fig. 5 Micrograph of Male different parts ofS.litorale-Bachu

表1S.litorale-Bachu与S.litorale、S.feltiae模式株形态特征比较，平均值(μm)±SD

Table 1 Comparison of Morphometric characters of threeSteinernemaspp. All Measurements are in microns and in the form: mean ±SD (range).

First generation Male第1代雄虫Infective juveniles侵染期幼虫First generation Female第1代雌虫Character 特征S.litoraleS.feltiaeS.litorale-BachuCharacter S.litoraleS.feltiaeS.litorale -BachuCharacter S.litoraleS.feltiaeS.litorale -BachuN 数量202030n202030n202030L 体长1 360 ±84(1 230-1 514)1 612 ±88(1 414-1 817)1 461.01 ±124.62(1 180.8-1 666.7)L909 ±42(834-988)879 ±49(766-928)885.88±73.15(761.83-1063.61)L4 462±325(3 930-5 048)3380(3 095-3 774)4 608.76±637.82(3 269.50-5 942.42)Body diam体宽96 ±7.9(82-111)140 ±10(121-162)95.98 ±12.63(71.12-118.16)a29.5 ±0.8(27.2-30.9)30 ±1.9(27-34)29.44 ±1.71(26.52-33.74)a23±1.4(21-26)17(14-20)/EP 头至排泄孔距离96 ±7.0(76.6-107)115 ±3.4(110-126)86.98 ±7.42(73.46-102.31)b7.3 ±0.3(6.7-7.9)6.4 ±0.3(5.8-6.8)6.83 ±0.36(6.16-7.45)b23±1.5(20-26)14(12-17)/NR 头至神经环距离114 ±10.8(94-128)/108.17 ±6.47(96.59-122.62)c11.0 ±0.5(9.7-11.9)10 ±0.5(9.4-11)11.88 ±0.66(10.42-13.30)c117±21(78-157)65(49-88)/ES 头至咽距离147 ±7.6(133-163)170 ±3.4(164-180)143.94 ±11.35(107.18-162.46)C/4.5 ±0.4(3.8-5.4)4.8 ±0.2(4.5-5.1)4.24 ±0.46(3.47-5.10)C/0.6±0.1(0.5-0.9)//Testis reflexion 精巢回折长度290 ±41(212-380)/347.57 ±45.88(235.54-432.80)Body diam31 ±1.4(28-33)29 ±1.9(26-32)30.12 ±2.29(25.83-35.53)Body diam.191±9.1(175-215)204(170-254)180.13 ±15.70(161.39-214.27)Tail length with sheath(T) 带鞘尾长34 ±3.7(26-41)39 ±1.2(37-43)34.92 ±2.68(30.49-42.02)EP61 ±3.3(54-69)63 ±2.3(58-67)62.25 ±2.44(56.89-66.85)EP88±12(65-105)/99.44 ±6.51(86.61-111.71)Anal body diam(ABD) 肛门体直径43 ±3(37-49)48 ±1.7(45-53)43.95 ±3.10(36.39-49.40)NR96 ±4.0(89-104)113 ±5.1(108-117)102.04 ±6.92(91.77-112.94)NR146±9.1(130-165)/130.20 ±12.23(115.98-162.01)Spicule length(SL) 交合刺75±4.8(67-89)66 ±1.5(62-68)69.49 ±4.51(61.42-75.92)ES125 ±4.6(114-133)136 ±3.5(130-143)129.78 ±8.45(118.08-145.95)ES196±8.2(185-213)237(197-304)184.65 ±12.64(164.81-217.53)Gubernaculums length (GL) 引带53 ±4.0(44-64)52 ±1.9(48-56)50.60 ±4.98(38.91-56.97)Tail length with sheath(T)83 ±4.5(72-91)86 ±2.6(81-89)74.81 ±7.52(59.98-88.61)Testis reflexion///D%=EP/ES×100/68 ±3.1(64-72)60.45 ±2.28(50.57-85.71)Anal body diam.(ABD)19 ±1.5(16 -22)18 ±0.8(16-19)17.66 ±0.88(16.37-20.03)Tail length with sheath(T)39±7.6(25-60)52(39-70)55.36±8.23(43.22-73.19)SW%=SL/ABD×100174 ±13(154-200)140 ±10(130-150)158.21 ±3.03(135.26-179.94)D%=EP/ES×10048.5 ±2.9(44.0-56.0)46 ±1.4(44-50)48.12 ±3.02(42.82-54.56)Anal body diam.(ABD)62±4.7(55-75)52(47-62)56.45 ±6.85(46.02-68.31)GS%=GL/SL×10071 ±4(62-81)80 ±3(70-90)72.67 ±2.85(52.71-85.66)E%=EP/T×10073.0 ±5.0(63.0-84.0)74 ±4(67-81)83.88 ±7.42(69.67-97.13)D%=EP/ES×10045±6.5(33-57)/54.08 ±5.02(51.36-56.62)

Note : EP=distance from anterior end to excretory pore; NR= distance from anterior end to nerve ring; ES= distance from anterior end to end of pharynx. L= body length, MBD= maximum body diameter, EP= distance from anterior end to excretory pore, NR =distance from anterior end to nerve ring, ES= pharynx length, T= tail length, a=L/MBD, b=L/ES, c=L/T, D%=EP/ES×100, E%=EP/T×100, ABD=anal body diameter, SL= spicule length, GL= gubernaculum length, SW%=spicule length/ABD×100, GS= guberculum/spicule×100; C’=T/ABD; MUC= mucron, A=absent; P= present; / =no data available

2.4 S. litorale-Bachu 杀虫活性测试

研究表明,分离获得的昆虫病原线虫在 24～48 h内为侵染致死大蜡螟幼虫的主要时间，尤其是24～36 h为侵染关键时间段，除低剂量10和20 IJs/Gm 在36 h之内校正致死率低于50%，随着剂量的增加其它试验组对大蜡螟校正致死率超过70%以上， 高剂量160 IJs/Gm 及其以上处理组36 h之内校正致死率达到100%；到60 h，低剂量10 IJs/Gm对大蜡螟幼虫校正死率达到49%，20 IJs/Gm校正致死率达到65%以上，其余处理组对大蜡螟校正致死率均达到100%。图6

新疆巴楚胡杨林昆虫病原线虫对黄粉虫幼虫也具有较高的侵染致死能力，在整个试验统计周期内剂量效应显著，在60 h内40 IJs/Tm及其以上剂量试验组对黄粉虫幼虫校正致死率均超过50%，其中160 IJs/Tm及以上试验组校正致死率超过75%；在72 h内，只有320与640 IJs/Tm校正致死率达到80%以上，其中640 IJs/Tm对黄粉虫幼虫校正致死率达到87%。图7

图6 不同剂量S.litorale-Bachu对大蜡螟的侵染力

Fig. 6 The infectivlity ofS.litorale-Bachu toG.mellonellaat different dosages

图7 不同剂量S.litorale-Bachu对黄粉虫的侵染力

Fig. 7 The infectivity ofS.litorale-Bachu toT.molitorat different dosages

3 讨 论

研究表明，在新疆尼勒克[22]、和田地区红枣绿豆间作田[24]等不同生境也陆续发现有昆虫病原线虫的分布，但在新疆胡杨林中是否存在，存在哪些种属还都未知。研究在新疆巴楚县夏马勒林场胡杨林土样中分离到海滨斯氏线虫为采样地存在的优势种；经过分子生物学、形态学鉴定与日本报道的属于同一属种，这是新疆发现海滨斯氏线虫的存在，也是首在新疆胡杨林中发现有昆虫病原线虫分布；并且其对大蜡螟幼虫和黄粉虫幼虫具有较高的侵染活性，具有潜在的害虫生防应用价值。与刘瑞等[20]的杀虫活性研究结果比较，相同剂量和时间下侵染大蜡螟幼虫活性较为一致，致死率均较高；而在同剂量和时间下对于黄粉虫侵染活性略低于文献报道，可能是由于不同研究中所使用的的黄粉虫幼虫的龄期或者不同品系侵染特性具有差异。

土壤样品采样地点巴楚县位于新疆南疆盆地特克拉玛干沙漠边缘，采集地天然胡杨林生长在塔河流域外围，常年干旱少雨且温度较高，夏季炎热，冬季寒冷，降水量少、蒸发量大，环境相对恶劣，此类线虫的发现一是证实在这种生态条件下昆虫病原线虫的分布和存在；同时也间接说明其对环境的适应性较强，具有较强的抗逆性。吕洋和韩岚岚等[25]研究证实海滨斯氏线虫S.litorale当地品种更适合应用于当地的寒冷气候，张旭霞和韩岚岚等[21]研究证明海滨斯氏线虫具有低温贮存性优异的特点，刘瑞和刘奇志[20]研究发现海滨斯氏线虫具有侵染力强和耐干燥力的特性，而研究中的线虫其相关特性有待进一步研究验证。在采集地的胡杨林中存在着大量的春尺蠖，而此次分离到的这种昆虫病原线虫能够存在于胡杨林土壤中，且呈优势存在，推测与春尺蠖有着密切的联系，春尺蠖可作为其维系繁育的虫源之一，这还需要进一步的研究和验证。在新疆天然胡杨林面积广大，新疆天然胡杨林重点分布在塔里木河沿岸，塔里木河流域胡杨林资源面积达100×104hm2(1 500多万亩)，占全国胡杨林面积90%以上，是我国天然胡杨林分布最集中的地区。广阔且生态多样的塔河流域胡杨林，其中可能蕴藏着许多不同属种、特性优异的昆虫病原线虫，后续研究将可开展大范围、大空间尺度塔河流域胡杨林昆虫病原线虫分离和收集，进一步系统研究存在于新疆塔河流域原始胡杨林中的昆虫病原线虫种群及其分布特征。

4 结 论

在新疆天然胡杨林中有EPNs的分布，分离到的此株线虫形态学分析其与Steinernemalitorale模式株大部分特征值基本吻合，主要区别为：第1代雄虫：体长略长(1 461.01 μm)、排泄孔至头部距离短(86.98 μm)、交合刺短(69.49 μm)、D%(60.45)与SW%158.21 值小于模式株；侵染期幼虫：体长(885.88 μm)和尾长(74.81μm)短、E%(83.88 )值大，18S rDNA系统发育树分析其在进化关系上与Steinernemalitoralestrain Pak.S.P.7 进化关系最近，鉴定为Steinernemalitorale的新疆亚种；16S rDNA系统发育树表明其共生细菌是Xenorhabdusbovienii。S.litorale-Bachu 对黄粉虫和大蜡螟幼虫均具有较高的侵染及致死力，在160 IJs/Gm 及其以上试验组36 h之内大蜡螟校正致死率达到100%，60 h内黄粉虫校正致死率超过75%。在新疆天然胡杨林中发现有EPNs的分布，Steinernemalitorale在采集地是优势种，同时其具有较强的杀虫能力。