硅酸钙生物材料诱导牙源性干细胞成牙/成骨分化机制的研究进展

周 杨，李 谨，朱庆萍，吴大明

自上世纪90年代以来，以硅酸三钙和硅酸二钙为主要成分的硅酸钙材料(calcium silicate cements, CSCs)备受关注。CSCs能释放生物活性离子Ca2+和Si4+，提高局部pH，促进磷灰石形成[1-2]；通过增加促血管生成因子(如VEGF、FGF)和内皮细胞中的受体表达来模拟缺氧条件刺激血管生成[3]。CSCs通过诱导信号分子、通路、受体和转录控制系统组成的复杂网络(表1)促进硬组织再生，诱导骨髓基质细胞(bone marrow derived stroma cell，BMSC)、牙髓细胞(dental pulp cell, DPSC)、牙周韧带细胞(periodontal ligament stem cell, PDLSC)、根尖乳头干细胞(stem cell of the apical papilla，SCAP)的成牙/成骨分化[4-39]。以三氧化物聚合物(mineral trioxide aggregate, MTA)为代表的CSCs已被广泛应用于盖髓术、牙髓切断术、穿孔修补和根尖屏障等牙髓治疗中[2-5]。本文就目前临床常见的CSCs的成牙/成骨相关机制进行综述。

表1 CSCs通过信号分子、通路、受体和转录控制系统诱导干细胞成牙/成骨分化Tab.1 CSCs induce odonto/osteogenic differentiation of stem cells via signal molecules，pathways，receptors and transcriptional control systems

1 MTA

MTA主要由硅酸三钙/二钙，铝酸三钙，铁铝酸四钙，石膏和二氧化铋组成，在溶液中呈碱性(pH为10.2～12.5), 具有良好的磷灰石形成能力[2]。与传统盖髓剂氢氧化钙[Ca(OH)2，CH]相比，MTA诱导牙本质桥形成的频率更高，且形成的牙本质更厚、孔隙更少，展现出良好的生物相容性、抗菌性、抗炎性和成骨性[7]。

MTA可刺激多种干细胞的成牙/成骨分化包括脂肪干细胞、BMSC、DPSC、PDLSC和SCAP，诱导硬组织再生。MTA诱导牙源性干细胞成牙/成骨分化的机制与释放Ca2+有关[4]。MTA释放Ca2+和OH-与组织间液中的磷酸基团反应形成羟磷灰石(hydroxy apatite, HA)，OH-参与矿化过程的ALP和BMP-2的释放，Ca2+浓度的局部增加上调了细胞外钙敏感受体(CaSR)活性，激活多种信号传导途径以促进不同谱系细胞分化[4]。Wang等发现MTA中的Ca2+触发ERK和p38途径修饰细胞表型，上调ALP、Runx2、OSX和OCN的表达，并证实MTA通过NF-κB、MAPK通路协同介导PDLSC的成牙/成骨分化[8]；Yan等证实MTA通过上调炎性细胞因子(IL-1α、IL-1β和TNF-α)、刺激IκB激酶(IKK)磷酸化和NF-κB亚基的易位，增强SCAP的成牙/成骨分化[9]。

MTA存在操作敏感性高、凝固时间长、导致牙齿变色等缺点[2]。另外，酸性环境能改变MTA表面显微结构，增加溶解性，抑制MTA的固化反应、降低封闭能力、削弱微硬度和对牙本质的结合能力[12]。应用纳米技术改性的MTA可以更快地与水反应，显著增加Ca2+释放，提升pH值，与活组织接触时炎症反应也较轻[10]。

2 iRoot

iRoot是一种新型CSCs纳米材料，主要由硅酸三钙/二钙、磷酸钙、氧化钽和氧化锆组成。与MTA不同的是，iRoot不含铝，由氧化钽和氧化锆替代二氧化铋作为阻射剂，规避二氧化铋导致的牙齿变色[2]。该类产品包括iRoot SP、iRoot BP、iRoot BP Plus、iRoot FS、iRoot FM等，这些新型材料可注射使用，不溶解收缩，封闭性好，具有良好的生物相容性、抗菌性和诱导成骨性能[11-14]。

iRoot SP通过活化整合素受体及下游信号分子，包括粘着斑激酶(FAK)、MAPK、NF-κB、Akt，诱导低水平炎症介质表达并增强PDLSC成骨分化[11]。

iRoot BP Plus展示与MTA相似或更好的HA形成能力、生物相容性和诱导成骨能力[12]。iRoot BP Plus直接盖髓后，在牙髓界面形成钙化桥，牙髓组织无炎症反应，且比MTA能更好地形成HA、促进细胞增殖和诱导成骨；在炎症导致的酸性环境中释放更多的Ca2+和Si4+，提升了细胞活性，有助于成骨细胞分化；释放的Si4+和OH-可抑制破骨细胞生成和骨吸收，改善根尖组织愈合[12]。此外，iRoot BP Plus可激活FGFR介导的MAPK和PI3K/Akt通路并促进DPSC的细胞迁移[13]。

iRoot FS和MTA有相似的根尖封闭能力和机械性能，能引起ALP、COL、OCN上调，促进人PDLSC的附着、增殖和生物矿化[15]。iRoot FS提升DPSC的增殖、迁移和成骨分化。DPSC间充质干细胞表面标记物CD29、CD44表达水平高于9%，CD105表达水平高于34%，内皮细胞标记物CD31或造血干细胞标记物CD34、CD35表达水平低于0.8%，提示DPSC展示持续和高典型的间充质干细胞表面标记表达，细胞增殖随着时间而增加[16]。iRoot FM也能显著增强SCAP的DMP-1和ALP表达，同时具有与CH相似的抗菌效果[17]。

不同的iRoot产品成分类似，但剂型不同，应用范围也有差异。由于iRoot是纳米改性，可即刻使用，有望成为MTA的替代品。但是iRoot固化时间与温度有关，温度升高后其流动性和多孔性降低，影响热压胶垂直加压充填的临床操作和充填质量。此外该材料在国内应用不久，目前仍缺乏大量临床实验以评价其在人体内促进牙本质桥形成能力、边缘封闭性等特性。

3 生物活性玻璃/介孔生物活性玻璃

以Bioglass 45S5为代表的生物玻璃(bioactive glasses, BG)，因其优异的生物相容性、促骨和血管生成能力而备受关注[19]。BG可刺激成骨细胞增殖并增加成骨细胞相关基因活性(如ALP、OPN和COL)，BG / HA / PE复合物促进了小鼠前成骨细胞MC3TC-E1增殖，其潜在机制是BG上调Runx2的表达并激活TAZ / YAP信号通路以加速骨化相关蛋白的产生[39]。

近年来，Yan等[19]通过溶胶-凝胶法制备内部含有有序介孔通道(5～20 nm)的介孔生物活性玻璃(mesoporous bioactive glasses, MBG)。相对于传统的BG，MBG的突出优势是其强大的药物负载与释放能力。MBG能与液体产生更快、更强的离子交换(主要是Ca2+和Si4+)，释放更强的成骨活性[18-19]。MBG促使更多的破骨细胞与胰岛素生长因子-1(IGF-1)结合，通过信号逐级反应降解骨细胞外基质(ECM)，同时分泌酸和蛋白水解酶，有助于骨骼重建[32]。Jia等[20]和Yin等[21]先后制备了负载锶(Sr)、硼(B)的MBG支架(Sr-MBG，B-MBG)，并证实Sr-MBG通过激活MAPK通路调节Setd2表达，B-MBG通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路调节Setd7表达，诱导成骨细胞分化和新骨形成。

与MTA相比，MBG独特的介孔结构可用作多功能、可调节的药物及生物活性分子递送平台，在诱导牙/骨新生的同时抵抗根管中细菌生物膜感染[1]。但MBG的粒径通常为微米级，不易注射，且固体粉末不利于药物输送，目前尚难以应用于临床的牙髓治疗。

4 介孔钙/硅纳米材料

介孔硅纳米粒子(mesoporous silica nanoparticle, MSN)因其良好的生物相容性和生物降解性，常被用作支架材料[22]。MSN通过水解Si—O键，释放正硅酸，生成水溶性Si，刺激人BMSC的COL合成和成骨分化[29]。MSN在消耗Ca/P荷载后持续释放正硅酸，因此在不同骨生成阶段均有骨刺激作用。

介孔钙硅纳米粒子(mesoporous calcium-silicate nanoparticles，MCSNs)元素组成近似MTA和iRoot，具有有序的介孔结构(平均5 nm)，高比表面积(平均300 m2/g)，富含Si—OH基团，能负载和缓释药物及生长因子，是优良的生物载体和骨再生平台[22-23]。Wu等[23]研究证实MCSNs具有良好的抗菌性、促HA形成、刺激PDLSC成骨基因表达等优点。MCSNs诱导干细胞成牙/成骨本质可能与Ca2+和Si4+的持续释放有关。Ca2+引起细胞内钙浓度增加，激活钙调蛋白(CaM)，进而使钙调依赖蛋白激酶(CaMKII)、钙调神经磷酸酶(Cn)活化，影响AP-1等转录因子家族基因的表达[4]；Si4+促使细胞进入S和G2期，增强细胞增殖分化，在骨和软骨形成、血管新生、胶原蛋白合成、结缔组织交联等组织再生中起关键作用；此外还能激活ERK途径诱导DPSC牙源性分化[24]。近来，Huang等[25]制备负载BMP-2的MCSNs复合支架，证实该支架作为BMP-2输送系统表现良好，不仅增强了DPSC成牙/成骨活性，而且提高了生长因子的释放速率。

MCSNs与MBG同属介孔材料，可携带药物或生物活性分子，在骨缺损修复、细胞内分子标记、药物传输和基因打靶等生物工程中有着广阔的应用前景。MCSNs与壳聚糖、聚己内酯等有机材料制备复合支架[33]，协同生长因子或生物活性元素，有望成为牙髓再生治疗中保护血凝块、诱导硬组织新生的内部支架；此外MCSNs负载抗菌药物，粘附于根管壁并渗入牙本质小管中[23]，可发展成为新型根管内消毒剂。然而，如何开发成熟的产品体系，最大效率发挥MCSNs生物学活性并兼顾操作便捷性，是未来研究的重点。

5 BioAggregate(BA)

BA是一种新型纳米CSCs，由水合硅酸钙、CH、HA及氧化钽组成，无牙变色风险，根尖封闭性及生物相容性与MTA相似[26-27]。BA通过MAPK途径诱导DPSC分化和矿化结节形成，上调DSPP和DMP-1的表达[27]。BA还能降低破骨细胞组织蛋白K(Cathepsin-K)及其上游活化T-细胞核因子1(NFATc1)和c-Fos的表达水平[26,38]，在LPS诱导的小鼠颅骨缺损模型中，BA表现出对体内破骨细胞分化和炎性骨吸收具有与MTA相当的抑制作用[26]。

BA成分与MTA相似，但不含铝，降低了对人体的潜在毒性，且BA中HA组分的存在增加了材料的强度，展现出优异的生物相容性、诱导硬组织形成能力。然而BA若要取代MTA尚存在较多问题，如在相同的环境下，BA的粘结性能弱于MTA，而理想的髓腔穿孔修补材料应与牙本质紧密连接以隔绝外界物质；如何增强BA抗菌作用以抵抗牙髓治疗后微生物再感染等也有待进一步研究。

6 BiodentineTM(BD)

BD是2009年问世的生物性牙本质替代材料，是一种高纯度硅酸三钙粉末，含少量的硅酸二钙、碳酸钙、氧化锆等,在抗压强度、粘合强度、密封性能及Ca2+释放能力等方面具有与MTA相当甚至更好的性能[6,30-31]。

BD用于直接盖髓时，诱导DPSC分泌TGF-β1刺激早期修复性牙本质生成[35]，该过程涉及MAPK和CaMKII通路，其中MAPK主要是ERK和JNK，选择性阻断p38途径则对成骨基因的表达没有明显影响[36]。BD通过调控血红素氧合酶l(HO-1)、活性氧(ROS)、Nrf2的表达诱导DPSC成牙本质细胞分化[34]。利用BD培养乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)的体外实验表明该材料有利于SHED的附着和增殖，并通过与细胞微环境离子交互触发牙源性分化[31]。此外，BD还可刺激SCAP血管生成基因(如VEGFA、VEGFD/ FIGF)的表达，显著降低血管生成素1(Ang 1)和FGF-2的mRNA水平，改善血管再生、软组织愈合[37]。Kim等建立大鼠牙髓损伤模型，采用ProRoot MTA、BA及BD盖髓，组织免疫分析和Micro-CT的结果表明BA和BD均可促进DPSC成牙/成骨分化，加快体内牙本质桥的形成[28]。

与MTA相比，BD凝固时间短，易于操作，应用于穿孔修复时具有良好的外推式粘合强度和修补效果；同时BD具有与天然牙本质类似的生物学性能及较高的机械强度，对于提升牙髓治疗后牙齿抗折性效果更为显著。BD是粉末胶囊剂型，颗粒均匀，孔隙度小，质地致密，与根管壁牙本质界面密封性能好，可大大减少细菌微渗漏[40]。上述特性使得BD在牙体牙髓疾病的临床治疗前景广阔。但是BD调制后一次使用不完易造成浪费，若自行调拌则会因粉液比不当而影响其固化时间，操作性仍需改进。

7 总 结

在牙髓病学领域，发展生物活性材料的重点是提高其抗菌效果、促进病变牙本质基质的机械完整性和组织再生[2]。生物安全性、生物相容性及生物功能性是生物活性材料研发的重点。上述CSCs在基础研究中被证实具有优异的成牙/成骨特性。 MTA已广泛应用于临床上，iRoot系列产品正逐渐普及，但其价格较高，让很多医生仍然选择了传统的MTA。其他几种CSCs目前在临床上尚未广泛推广，其临床疗效仍需大量的病例和长时间的追踪来客观评价。