青皮对主要致龋细菌生长的影响及网络药理学分析其防龋机制

吴泽钰，薛 瑞，袁曦玉，从兆霞，赵 今

龋病是最常见的口腔疾病，是以细菌为主的多种因素影响下，牙体硬组织发生慢性进行性破坏的疾病[1]。中药中的植物药被认为是一类有效防治龋病的药物[2]。植物药以粗提取物的形式治疗各种疾病，被证实具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等作用[2]，植物药制剂已经在龋病和牙髓疾病的治疗中广泛应用[2-3]。青皮 (Citrusreticulate) 为芸香科植物橘(CitrusreticulateBlanco)的干燥幼果或未成熟果实的果皮；味苦、辛, 性温；归肝、胆、胃经；具有疏散退热、舒肝解郁等作用[4]。青皮主要成分为多种氨基酸、黄酮类化合物等,柚皮素和柚皮苷为其主要防龋抑菌的有效活性成分。

网络药理学(network pharmacology) 是结合系统生物学、多向药理学和网络分析等技术，基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络的基础上，利用网络分析软件计算，系统、整体地揭示疾病-疾病、疾病-靶点、靶点-药物之间的关联[5]。本文采用网络药理学方法从整体性的角度对青皮的防龋作用机制进行探讨，并使用青皮粗提取物对主要致龋细菌的生长产生影响，为进一步研究青皮临床应用价值提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 体外抑菌试验

1.1.1 药材提取 购买干燥青皮药材(购自新疆参茸中维药饮片有限公司)，粉碎，过60目筛。称取500 g青皮粉末浸泡于95%乙醇中浸提24 h，重复浸提3次，料液比1∶10，合并3次浸取液。将浸取液抽滤，滤液旋转蒸发器40 ℃下减压浓缩至无乙醇馏出为止, 在低温冷冻干燥放置冰箱4 ℃以下备用。

1.1.2 菌株及培养基 变形链球菌(S.mutansUA159)、血链球菌(S.sanguisATCC10556)、远缘链球菌(S.sobrinusATCC6715)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilusATCC4356)、黏性放线菌(A.viscosusATCC19246)、内氏放线菌(A.naeslundiiATCC12104)以上菌株均购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)。脑-心浸液培养基(BHI)：称量3.7 g BHI培养基，加100 mL蒸馏水溶解，121 ℃ 15 min高压灭菌，调整pH=7.0±0.2。嗜酸乳杆菌用乳酸细菌培养基(MRS)培养。

1.1.3 最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)及最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)的测定 青皮提取物按二倍稀释法溶于含1%葡萄糖BHI、MRS液体培养基中，最终浓度8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 g/L(DMSO的最终浓度为1%，无杀菌作用)。分光光度计调整菌悬液密度至1×107cfu/mL(OD630=0.2)备用，将菌悬液与药液按照1∶1(V∶V)比例，各100 μL接种于96孔板中。用震荡l min后，变形链球菌、血链球菌、远缘链球菌和内氏放线菌置于厌氧条件(80%N2，20%CO2)，黏放线菌和嗜酸乳杆菌置于5%的CO2恒温培养箱，37 ℃培养24 h。ΔOD≤0.05的最低浓度为MIC。选择>MIC浓度的各孔，取20 μL涂布于BHI、MRS固体培养基上，37 ℃培养24 h，菌落数少于5～6个的最低浓度为MBC。重复3次。

1.2 青皮化学成分筛选及作用基因获取

利用中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索青皮的化学成分，查阅并整理化学成分及作用靶点。利用PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)和ChemBL(https://www.ebi.ac.uk)确定青皮化学成分三维结构，建立青皮化学成分的数据库。将基因名转换为UniProt数据库中的Gene Symbol。

1.3 龋病靶点基因的筛选

通过在Gene Cards (https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/search)中输入关键词dental caries、caries等搜索相关基因，与上述青皮化学成分的药物作用靶点进行匹配，得到青皮化学成分防龋的潜在作用靶点。

1.4 成分-作用靶点网络构建与分析

为了阐明青皮化学成分防龋机制，构建了化合物-靶点相互作用网络，预测成分与靶点对应关系。将青皮化学成分、作用靶点导入Cytoscape 3.7.1软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，然后利用 Network Analyzer工具计算网络拓扑参数，包括度值(degree)、拓扑系数(topological coefficient)[6]。采用网络分析方法，确定关键节点，探讨青皮化学成分的主要作用靶点及其作用机制。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)数据

利用STRING 11.0数据库[7](https://string-db.org)提供预测靶点蛋白之间的作用网络。物种限于“Homo sapiens”，置信度得分>0.4。选择连接前10个的靶基因作为青皮防龋过程的中心基因。

1.6 基因本体(gene ontology, GO) 富集分析

生物学信息注释数据库(DAVID, https://david.ncifcrf.gov)为大规模基因或蛋白列表提供系统综合的生物功能注释信息，找出显著富集的生物学注释[8]。使用DAVID对靶点进行GO富集分析[9]，用FDR<0.05对P值作检验校正，最终阈值P<0.01，筛选有显著性差异的生物过程，利用R软件绘图。

1.7 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析

使用KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)[10]对靶点进行富集分析。输入物种为“Homo Sapiens”，输入靶点，进行KEGG[11]信号通路富集分析以及相关的通路图，并利用R软件绘图。

2 结 果

2.1 青皮提取物对6种主要致龋菌MIC、MBC结果

实验结果表明，青皮提取物对6种主要致龋菌均存在抑制作用，青皮提取物浓度分别为1.0, 0.5, 1.0, 2.0, 2.0, 2.0 g/L的S.mutans,S.sanguis,S.sobrinus,A.viscosus,A.naeslundiiandL.acidophilus菌液明显澄清，酶标仪测ΔOD<0.05。结果详见表1。

表1 青皮提取物对6种主要致龋菌MIC、MBC的实验结果Tab.1 MIC and MBC values of Citrus reticulate extract to the six main cariogenic bacteria g/L

2.2 青皮化学成分的筛选

TCMSP数据库获得青皮化学成分18个,根据青皮各成分的含量、生物利用度(OB)、类药性(DL)结合本实验室的研究筛选出潜在防龋作用的化学成分12个, 详见表2。

2.3 青皮作用于龋病相关靶点

青皮的12个化学成分在TCMSP、Drugbank数据库中获得靶点232个, 去重后92个。通过Uniprot数据库搜索靶点Gene symbol。通过GeneCards、OMIM数据库得到1 171个龋病相关基因, 与青皮作用靶点进行比对取交集, 筛选出28个可能与青皮防龋相关的作用靶点, 详见图1，表3。

图1 Venn图Fig.1 Venn diagram

表2 用于网络药理分析的青皮的化学成分Tab.2 Chemical components of Citrus reticulate for network pharmacology analysis

表3 可能与青皮预防龋病相关的靶点Tab.3 Targets related to the prevention of caries

2.4 化合物-靶点网络构建与分析

运用Cytoscape软件构建成分-靶点网络，如图2所示。图中共42个节点(12个成分，28个靶点)和1 722条边。网络拓扑学结构分析显示，化合物的平均度数为5.917，说明青皮防龋有多靶点属性，其中度数较大(度数>10)的化合物为柚皮素、川陈皮素。化合物拓扑学参数见表2。同时，许多靶点与多种成分相关，这可能表明青皮发挥药效过程中不同化合物具有协同作用。

图2 青皮化合物-靶点网络图Fig.2 Citrus reticulate chemical components-targets network diagram

2.5 蛋白-蛋白网络构建与分析

STRING获取28个靶点的PPI关系。选择组合得分>0.4，PPI关系网络有28个节点和156个边缘(图3A)。选择连接性最高的10个靶基因作为防龋的中心基因(图3B)， 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、 半胱天冬酶-3(caspase 3，CASP3)、 过氧化氢酶(catalase，CAT)、 丝裂原激活的蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)等。

A：每个节点代表相关靶点，边缘越多，关联越强；B：PPI网络中的基因边缘数排序

图3青皮化学成分预防龋病靶蛋白-蛋白相互作用

Fig.3Citrusreticulatechemical components prevent cariesTargets protein-protein interaction

2.6 GO富集分析

David数据库进行GO富集分析，参数设置P<0. 01，得到74个注释信息，分为：①生物过程(biological Process，BP)，获得52条结果，主要涉及对过氧化氢的反应、对糖皮质激素的反应、对缺氧的反应等方面;②分子功能(molecular function，MF)，获得11条结果，主要涉及蛋白质同源二聚化活性、蛋白结合、蛋白酶结合等方面;③细胞组分(cellular component，CC)，获得11条结果，线粒体、细胞外泌体、细胞质等方面，见表4，图4。

2.7 KEGG通路富集分析

利用KOBAS数据库进行KEGG 通路富集分析，P<0.01，FDR校正后的Q<0.01共获得110条结果。前20条通路，包括了4条信号通路(AGE-RAGE、TNF、NF-κB、HIF-1和癌症通路)，6条生物系统相关通路(内分泌抵抗，细胞凋亡，5-羟色胺能突触等) 和10条疾病通路(乙型肝炎，肌萎缩侧索硬化症，结直肠癌等)。见表5，图5。

表4 青皮对相应基因GO富集分析结果(各前5条)Tab.4 The results of Citrus reticulate anti-caries corresponding genes GO enrichment analysis (Top 5)

表5 青皮对相应基因KEGG富集分析(前10条)Tab.5 The results of Citrus reticulate anti-caries corresponding genes KEGG enrichment (Top 10)

图4 潜在靶点生物学过程的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of potential targets biological processes

图5 潜在靶点生物学过程的KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of potential targets biological processes

3 讨 论

植物药衍生的次级代谢产物，包括不同类型的黄酮类物质、糖苷、生物碱等，大多是潜在的天然抑菌物质[12]。利用植物药防治龋病是目前研究的热点。本实验结果表明，青皮提取物能够有效抑制主要致龋菌的生长，对链球菌表现出较强的抑制作用，具有一定的杀菌作用。国内外相关研究表明，青皮提取物对多种细菌的生长具有抑制作用，陈青等[13]研究青皮挥发油对金葡菌等有抑菌作用，MIC在0.31～1.25 g/L；Yue等[14]研究发现柚皮素对变形链球菌的MIC在100～200 μg/mL,且减少生物膜形成，都与本研究结果一致。青皮中发挥抑菌作用的成分主要为柚皮素、柚皮苷、橙花醛等。于倩等[15]研究表明伊犁黑蜂蜂胶对主要致龋菌的MIC为4、2、8、2、1 g/L，李梦琪等[16]研究发现紫地榆对致龋菌的MIC为0.5～4.0 g/L。本实验结果发现青皮提取物对致龋菌的MIC浓度低于蜂胶及紫地榆提取物，提示青皮可能是效果更佳的潜在防龋药物。

网络药理学方法整体性、系统性的特点与中医药整体辨证原则不谋而合[17]。本研究利用网络药理学，构建“青皮-成分-靶标-龋病”调控网络，系统分析青皮化学成分多途径防治龋病的潜在机制。最终获得12个成分，28个靶点，调控网络显示柚皮素、甜橙黄酮、萜基烯等匹配多靶点，是青皮防龋关键成分。靶点中TNF、CASP3、CAT等处于网络中心位置，可能是青皮防龋调控网络的潜在调节因子。研究证明川陈皮素、柚皮素能抑制TNF、 基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)的表达[18-19]。龋病发生时，细菌刺激牙髓单核/巨噬细胞、中性粒细胞系统等产生TNF，激活免疫系统参与清除感染[20]。MMPs 家族是重要的生物活性剂，参与了病理过程中细胞外基质的崩解，能够调节牙本质修复的潜能[21]。

将28个靶点进行GO富集分析，青皮化学成分主要涉及蛋白结合、蛋白酶结合、对过氧化氢的反应等生物过程，涉及细胞器、细胞膜和细胞质等细胞组分，是一个复杂的调控过程。KEGG富集分析获得110条结果，青皮防龋的潜在信号通路主要为年龄-糖基化终产物受体蛋白信号通路(age-receptor for advanced glycation endproducts signaling pathway，AGE-RAGE通路)、TNF通路、NF-κB通路(核因子-κB信号通路，nuclear factor -kappa B signaling pathway)等。其中AGE-RAGE信号通路能够激活多条信号转导通路，如TNF、NF-κB信号通路、信号转导蛋白和转录途径等[22]，NF-κB活化又可上调RAGE。AGE-RAGE激活NF-κB或其他途径释放与龋病相关的细胞因子，如TNF、MMP、 前列腺素-内过氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS)等[23]，能够促进氧化应激，降低抗氧化酶，降低糖的利用，抑制细菌定植于牙面。

本研究既探讨青皮提取物对主要致龋菌生长抑制作用，又应用网络药理学方法对青皮潜在防龋的成分、作用靶点和机制进行了探索性研究。由于数据库信息的不全面，未考虑不同化学成之间的协同作用等影响，网络预测的结果具有一定的片面性和局限性。但是，初步验证了青皮能有效抑制主要致龋菌的生长，以及网络药理学也显示出青皮防治龋病的药理活性及作用机制，为将来进一步深入探讨防龋机制的研究提供了实验和理论依据。