QIAamp DNA Investigator 试剂盒提取腐败肋软骨1例

（广东正孚法医毒物司法鉴定所，广东广州 510663）

1 案例检验

1.1 检材来源

受交警委托，本单位受理了1 例在交通事故身亡的死者肋软骨，要求将死者与疑似父母进行亲权鉴定。送检的肋软骨呈淡黄色，表面附着灰褐色腐肉。

1.2 DNA提取

先去除肋软骨周围的腐败组织等表面垢物，用灭菌超纯水冲洗干净。用干净手术刀片切除四周后从深中部切取5mm×5mm×1mm 共2份肋软骨，放入1.5mL 离心管中，分别用Chelex-100 法和QIAamp DNA Investigator 试剂盒（硅珠法）进行提取。

1.2.1 Chelex-100法

加入300μL 5%Chelex-100、10mg/mL 蛋白酶K 10μL，56℃消化2h，期间多次涡旋混匀，置于98℃加热煮沸10min，13000r/min 离心5min，取上清备用。

1.2.2 硅珠法

按照德国QIAGEN 公司的QIAamp DNA Investigator试剂盒说明书进行DNA提取操作。

1.3 DNA扩增及电泳

选用Thermo Fisher 公司的华夏白金试剂盒，扩增体系为15μL，取DNA上清2μL，加入Master Mix 6μL、Primer Mix 6μL、PnG Buffer 1μL。同时设置阴阳性对照。

扩增参数：95℃变性1min；94℃3s、59℃16s、65℃29s，30 个循环；60℃终延伸15 min；4℃保存备用。扩增产物在3130XL遗传分析仪上电泳，数据经GeneMapper ID-X 软件进行分析。

2 结果

2.1 采用Chelex-100法和QIAamp DNA Investigator 试剂盒法提取腐败肋软骨DNA，结果显示，用Chelex-100法提取的DNA未得到有效扩增（见图1）；而用硅珠法提取的DNA，包括1 个Amelogin 位点、1 个Y-Indel 位点在内，共25个基因座获得成功分型（见图2）。

2.2 将死者肋软骨STR 分型数据与疑似父母的分型结果进行比对分析，死者所有基因座上的等位基因均能从疑似父母双方找到来源，按照GB/T37223-2018进行亲权指数的计算，累积亲权指数CPI均大于10000，达到认定亲权关系的标准。

图1 Chelex-100法

3 讨论

对于新鲜肋软骨，直接扩增法或Chelex-100法便可成功获得STR分型［1～3］。但在实际检案中发现［4］，肋软骨的腐败程度与年龄、死亡时间、离体时间、保存条件等相关，可表现为色泽、气味等方面的变化。儿童、婴幼儿因其体内水分比例较成年人高，故死后变化发展较快，肋软骨腐败程度较成年人要高。死者年龄越大，肋软骨钙化程度越高，色泽上常呈黄色。死亡或离体时间较长且保存不当的肋软骨也容易出现腐败，在色泽上多表现为灰黑色，且常在微生物的分解下产生难闻的气味。提取肋软骨DNA前，首先通过最直观的色泽与色味可初步判断肋软骨是否有腐败迹象，以便高效选择适宜的DNA提取方法。

本单位受理的该例肋软骨，来自一名儿童，检材表面附着大量灰褐色组织，有气味产生，提示已出现腐败，状态较差。采用Chelex-100 法未能获得有效STR 分型的原因，很可能是检材因腐败而携带了较多影响下一步PCR 反应的抑制物，而Chelex-100 法纯化该类腐败检材DNA 的能力有限，故未获得足量纯度高的DNA 模板，最终导致扩增失败。而QIAamp DNA Investigator 试剂盒的原理是硅珠法。该法通过裂解消化，过二氧化硅膜柱子特异吸附，反复漂洗等纯化步骤，洗脱后的DNA较纯，利于下一步扩增。这也是该例腐败肋软骨更换试剂盒提取方法后成功检出STR分型的重要原因。

图2 硅珠法

实验中还须注意几点：（1）切取的肋软骨切片大小须适中，厚度应小于1mm，并适当剪碎以促进DNA释放；（2）根据检材状态，严重腐败的肋软骨要适当增加取材量；（3）为减少抑制物的影响，应尽量选取腐败程度较小的中间部位。本案中笔者用手术刀片切除肋软骨表面灰褐色腐败部分，为避免带入刀片上附着的腐败组织，更换了新的刀片再切取中间部位；（4）必要时增大扩增体系以降低抑制物的浓度。

综上所述，提取肋软骨的DNA，要注意结合案情，尽量了解死者的年龄、死亡时间、环境因素等，并观察肋软骨的色泽，以便更好地判断肋软骨的腐败情况，从而选择更合适的提取方法。对于腐败肋软骨，可直接选用包含纯化步骤的提取方法（如硅珠法、磁珠法等），既可保证检出率，又可避免多次检验，减少检材浪费，缩短检验时间。