BST-2在pSS患者唇腺、外周血淋巴细胞中的表达及增殖作用*

2020-03-17高尔涵达林泰巴格那杨文博孙明启

国际检验医学杂志 2020年5期

张硕，高尔涵，达林泰，巴格那，杨文博，孙明启

(1.内蒙古自治区人民医院口腔科,内蒙古呼和浩特 010017；2.内蒙古医科大学附属医院口腔科，内蒙古呼和浩特 010059)

舍格伦综合征是指泪腺、唾液腺等外分泌腺的淋巴细胞浸润，出现进行性破坏的慢性自身免疫性疾病，临床主要特征为眼干、口干等症状，临床又称干燥综合征。原发性舍格伦综合征(pSS)是指病变主要局限于自身外分泌腺；伴发其他自身免疫性病变者称为继发性舍格伦综合征[1]。pSS的发病机制尚待深入研究，可能与激素水平紊乱、遗传易感性、病毒等诱发因素密切相关。骨髓基质细胞抗原2(BST-2)是一种天然免疫蛋白，属于Ⅱ型跨膜蛋白，其相对分子质量为(30～36)×103。有研究指出，BST-2的表达主要受转录激活因子3和活化信号传导的调控，肿瘤细胞中的BST-2过量表达可促使癌细胞侵袭、迁移、增殖[2]。本研究探讨了pSS患者唇腺及外周血淋巴细胞中BST-2的表达水平及其对淋巴细胞增殖的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料将2017年9月至2018年3月在内蒙古自治区人民医院接受诊治的40例pSS患者纳入研究作为pSS组，男22例、女18例，年龄25～64岁，平均(46.8±4.2)岁，类风湿因子(150.3±73.4)IU/mL，C反应蛋白(4.5±0.8)mg/L，红细胞沉降率(22.4±3.1)mm/h，平均病程(34.2±6.8)个月。纳入标准：符合世界卫生组织制定的pSS的诊断标准[3]；经临床检查、影像学检查、实验学检查确诊；均为初诊患者。将同期40例体检健康者作为对照组，男21例、女19例，年龄25～64岁，平均(46.7±4.1)岁。本研究经内蒙古自治区人民医院医学伦理委员会审批通过，全部纳入研究者均自愿参加本研究并签署知情同意书。排除标准：接受免疫抑制剂、激素治疗者及原发性自身免疫疾病患者。pSS组和对照组的平均年龄、性别构成等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2仪器与试剂主要仪器包括美国BD公司生产的BD Calibur型流式细胞仪，北京天根生化科技公司生产的高速组织研磨器，美国Eppendorf公司生产的Centrifuge 5417R型台式高速冷冻离心机，美国ABI公司生产的ABI PRISM 7300型实时荧光定量PCR扩增仪。检测试剂包括美国BD公司提供的APC凋亡检测试剂盒，日本同仁化学科技公司生产的CCK-8试剂盒，上海领科生物技术有限公司生产的慢病毒包装的BST-2过表达载体，美国Sigma公司生产的RPMI 1640培养基，上海基因科技有限公司提供的免疫组织化学二抗试剂盒，美国Abcam公司生产的BST-2、CD19单克隆抗体，上海生工生物技术有限公司生产的BST-2引物，日本Takara公司生产的PCR定量试剂盒、反转录试剂盒，美国Invitrogen公司生产的Trizol裂解液，加拿大Cedarlane公司生产的人淋巴细胞分离液。

1.3标本收集

1.3.1切取标本全部患者接受唇腺活检手术，取部分唇腺标本，予以甲醛溶液固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作连续切片，厚4 μm，予以病理学诊断及免疫组织化学染色。其他标本置存于液氮内备用。

1.3.2外周单个核细胞分选空腹采集15 mL静脉血，在装有枸橼酸钠抗凝剂的无菌试管内。外周血单个核细胞(PBMC)用淋巴细胞分离液分选，采集三分之一离心后加入Trizol裂解液1 mL，在-20 ℃环境下放置备用。

1.3.3分选B淋巴细胞将预留的PBMC悬液离心10 min，1 500 r/min，除去上清液，加入磁珠缓冲液80 mL，予以EDTA磁珠缓冲液(终浓度为2 mmol/L，含0.5%BSA)，加入磁珠抗体(CD19)20 μL，冰上孵育20 min，加入缓冲液500 μL重悬，移取至分选柱，缓冲液500 μL润洗，流净细胞混合液后，加入2次缓冲液500 μL，转移分选柱至新的离心管内(容积15 mL)，滴加缓冲液1 mL，针芯推送液体至离心管内，获得分选出的CD19阳性标记细胞(B淋巴细胞)，离心10 min，除去上清液，加入裂解液1 mL备用。

1.4方法实时定量PCR检测：抽提的唇腺组织RNA中加入Trizol，予以高速组织研磨器研磨至匀浆状态，加入Trizol细胞裂解液，室温置存5 min，加入氯仿200 μL，剧烈震荡15 s，室温置存10 min，4 ℃离心15 min，12 000 r/min，吸取离心后的上层水相至EP管内，加入体积相同的异丙醇，轻轻混匀；室温下孵育10 min后，4 ℃离心15 min，12 000 r/min，除去上清液，加入75%乙醇1 mL，混匀，无水乙醇，4 ℃离心15 min，8 000 r/min，除去上清液，室温晾干后，加入DEPC水，混匀吹打后，RNA纯度及浓度予以分光光度计检测。根据试剂说明书操作PCR扩增，由上海生工生物公司合成引物，以管家基因β-actin表达量为内参分析数据。根据试剂盒说明书操作完成免疫组织化学检测。

2 结果

2.1实时定量PCR检测两组外周血B淋巴细胞和唇腺组织的BST-2表达 pSS组的外周血B淋巴细胞和唇腺组织中BST-2的表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2免疫组织化学法检测唇腺组织内BST-2的表达 pSS患者唇腺组织中，在浸润的局灶性淋巴细胞和少数周围导管上皮细胞内BST-2表达量较高，而在对照组中仅在导管上皮细胞内散在性少量表达，见图1。pSS患者唇腺组织的连续切片免疫组织化学染色显示，唇腺组织内浸润的局灶性淋巴细胞表达BST-2和CD19，CD19染色阳性细胞和BST-2阳性表达细胞基本一致，见图2。

表1 两组间外周血和唇腺组织中BST-2的相对表达水平比较

注：A、B为pSS患者唇腺组织切片染色(A为200×，B为400×)；C、D为对照组唇腺组织切片染色(C为200×，D为400×)；箭头表示BST-2阳性染色。

图1免疫组织化学法检测唇腺组织内BST-2的表达情况

注：A、B为pSS组唇腺组织BST-2染色(A为200×，B为400×)；C、D为pSS组唇腺组织内CD19染色(C为200×，D为400×)；箭头表示BST-2阳性染色。

图2免疫组织化学法检测唇腺组织连续切片的BST-2和CD19表达

3 讨论

目前多数研究BST-2的学者主要将精力集中在其对病毒复制的调控上，BST-2通过限制病毒扩散，从而抑制反转录病毒感染[4-5]。同时BST-2作为病毒感染的“感受器”，能诱导NF-κB活性，发挥出免疫防御功能[6]。BST-2能促进人巨细胞病毒进入单核细胞，增强人巨细胞病毒的感染性[7-8]。还有研究显示，BST-2可作为免疫球蛋白样转录因子7的配体，调控浆细胞样树突细胞分泌促炎因子[9-10]。因此部分学者认为BST-2对病毒起到双重作用，从而导致机体免疫功能紊乱，引起pSS的发生[11-13]。但BST-2在pSS中具体作用机制如何尚未完全明确。检测pSS患者唇腺及外周血淋巴细胞中BST-2的表达情况，探讨其对淋巴细胞增殖的作用已成为医学研究的热点[14-16]。

本研究探讨了pSS患者唇腺组织及外周血淋巴细胞中BST-2的表达情况及其对淋巴细胞增殖的作用。实时定量PCR检测显示，pSS组的外周血B淋巴细胞和唇腺组织中的BST-2表达水平明显高于对照组；免疫组织化学检测显示，pSS组唇腺组织中的局灶性浸润淋巴细胞和少数周围导管上皮内BST-2均有阳性表达，而在对照组中仅在导管上皮细胞内有散在性的阳性表达。根据外周血B淋巴细胞BST-2的表达情况分析，唇腺组织内的B淋巴细胞也可能表达BST-2。对pSS组唇腺组织进行连续切片的标本分别进行BST-2和CD19的染色，CD19染色阳性细胞和BST-2阳性细胞基本一致，与姜季委等[17]的研究结果大体一致。BST-2主要通过多病毒的复制进行调控，对病毒的扩散进行限制，对反转录病毒感染进行抑制；BST-2可作为病毒感染的“感受器”[18-19]，对NF-κB的活性进行诱导，发挥其免疫防御功能。骨髓基质细胞抗原-2可促使人巨细胞病毒进入单核细胞等表达BST-2的细胞内，增强人巨细胞病毒的感染性[20]。同时，BST-2可作为免疫球蛋白样转录因子7的配体发挥功能，对浆细胞样树突细胞产生的其他促炎因子及IFN进行调控，BST-2对病毒的双重作用引发机体免疫功能失衡，进而导致pSS的发病。