化学模式识别分析白及不同采收期次生代谢产物动态变化特征

秦亚东，汪荣斌，方凤满，李林华

1安徽中医药高等专科学校药学系；2安徽师范大学生命科学学院，芜湖 241002

白及为兰科植物白及Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f.的干燥块茎，具收敛止血、消肿生肌之功[1]，作为临床常用药材，具悠久的药用历史。白及主要含有联苄类、菲类、菲醌类、联苯并菲类、黄酮类及2-异丁基苹果酸葡萄糖氧基苄酯类等化学物质[2,6,7]，现代研究表明这些次生代谢产物在抗菌[3,4]、抗肿瘤[5,6]、抗炎[7]等方面不断显示新的活性。

近年来由于市场对白及的需求量增加，野生白及资源遭到了掠夺性采挖，面临灭绝的危险，市场供应主要依靠人工栽培品。众所周知，药用植物次生代谢产物的含量与产地、环境、采收时期及加工等因素关系密切，代谢产物的种类及含量可能会对临床疗效产生影响。已有文献报道白及主要有效成分含量与海拔高度关系密切[8]、野生与栽培品中天麻素(gastrodin，GAS)和1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine，MIL)含量存在较大差异[9]；同时学者对不同产地白及指纹图谱及多指标含量进行测定的基础上对白及质量评价及栽培品质量研究进行了有益尝试[9-11]。但对白及不同采收期，差异次生代谢产物及其动态变化规律研究尚未见报道。本文利用HPLC建立白及栽培品不同采收期次生代谢产物指纹图谱，结合化学模式识别不同采收期特征差异成分及其动态变化规律，同时采用高效液相色谱-高分辨质谱(HPLC-HRMS)技术对特征差异次生代谢产物进行定性分析，阐明特征差异代谢产物随季节变化规律，以期为指导白及采收期及内在质量评价提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 仪器

Agilent 1290型超高效液相色谱色谱仪(Agilent,USA)、Shimadzu LC-20AD型高效液色谱相色谱仪(Kyoto，Japan)、AB Sciex Triple TOF 5600型高分辨串联质谱仪(AB SCIEX，America)、DV215CD型 Discovery电子天平(Ohaus，USA)、JK-250DB型超声波清洗仪(合肥金尼克机械制造有限公司)、Minispin型台式离心机(Eppendorf，Germany)。

1.2 材料

引种安徽省南陵县何湾镇野生白及，经安徽中医药高等专科学校汪荣斌副教授鉴定为兰科植物白及Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f.，栽培于安徽中医药高等专科学校药苑，栽培3年后，自2014年11月起每间隔半个月采集地下块茎，样品编号信息见表1。按《中国药典》方法[1]除去泥土及须根后，置沸水煮15 min，晒至半干，除去外皮，晒干，粉碎后过40目筛，装密封袋置4 ℃冰箱中储存备用。

表1 白及样品信息及两个主要差异性成分的含量(mg/g)

续表1(Continued Tab.1)

样品编号Sample No.采集时间Collection date天麻素GAS1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯MIL季节SeasonS202015.8.282.1922.584S212015.9.151.8424.094S222015.9.292.5119.014S232015.10.142.2522.094S242015.11.23.2617.884

1.3 试药和试剂

GAS(批号：110807-201605)对照品购自中国食品药品检定研究院、MIL(批号：lot16122231)对照品购自上海远慕生物科技有限公司；乙腈、甲酸为色谱级(TEDIA，USA)、水为实验室自制超纯水、其余试剂为市售分析纯。

2 方法和结果

2.1 供试品溶液的制备

精密称取白及粉末约0.5 g，置于15 mL具塞离心管中，精密加入60%(V∶V)甲醇-水溶液10 mL,控制超声温度不超过20 ℃，超声1 h后离心处理(3 000 rpm)5 min，上层溶液过0.22 μm微孔有机滤膜，取续滤液，备用。

2.2 对照品溶液的制备

精密称定GAS、MIL对照品适量，分别置于10 mL棕色容量瓶中，加60%(V∶V)甲醇-水溶液定容至刻度。精密量取GAS、MIL对照品溶液适量混合，摇匀后为混合对照品溶液，分别过0.22 μm微孔有机滤膜，取续滤液，备用。

2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18column(50×4.6 mm，1.8 μm)，保护柱：Agilent SB-C18column(5×2.1 mm，1.8 μm)；流动相为溶剂A：0.1%甲酸乙腈，溶剂B：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱，0～10 min，溶剂A由5%→20%，10～18 min，溶剂A由20%→30%，18～23 min，溶剂A 30%，23～30 min,溶剂A由30%→33%，30～45 min,溶剂A由33%→60%；流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，检测波长285 nm，进样量5 μL，典型色谱图如图1所示。

图1 混合对照品(A)及白及典型样品(B)HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of two mixed standards(A) and representative HPLC chromatograms of sample(B)注：1.天麻素；2.1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯。Note:1.GAS,2.MIL.

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验

取S5样品，按上述条件制备供试品溶液,重复进样6次,记录各共有峰峰面积及保留时间，以MIL

色谱峰为参照，各共有峰相对峰面积及相对保留时间的RSD值均小于0.21%和0.72%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验

取S5样品，按上述条件制备供试品溶液,分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录各共有有峰峰面积和保留时间，以MIL色谱峰为参照，各共有峰相对峰面积及相对保留时间RSD值分别小于0.25%和1.24%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验

取S5号样品6份,按上述条件制备供试品溶液，按上述条件获取6份供试品指纹图谱，记录各共有峰峰面积和保留时间，以MIL色谱峰为参照，各共有峰相对峰面积及相对保留时间RSD值分别小于0.46%和1.57%，表明重复性符合指纹图谱要求。

2.5 指纹图谱的建立

白及样品按上述方法处理并进行测定。数据以AIA.格式导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件(中国药典委员会，2004A版)，以S1号样品为参照，时间窗宽度为0.1，采用中位数法，经多点校正、自动匹配共生成共有峰16个。285 nm检测波长下指纹图谱叠加图如图2。

图2 24批白及样品的HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints of the 24 batches of Bletilla striata samples

2.6 定量分析

参照文献[9-11]，利用外标一点法对GAS和MIL进行定量计算，结果见表1所示。由表1直观分析可见，GAS在Class1(S1～S6，冬季)和Class2(S7～S12，春季)样品中的含量高于Class3样品(S13～S18，夏季)和Class4(S19～S24，秋季)，GAS在冬、春季节平均含量是夏、秋季节的1.76倍，全年最高含量是最低含量的3.69倍；而MIL则相反，其在Class3和Class4样品中的含量高于Class1和Class2样品，MIL在夏、秋季节的平均含量是冬、春季节的1.53倍，全年最高含量是最低含量的2.67倍。

2.7 液质条件及特征峰定性分析

使用岛津Shimadzu LC-20AD型HPLC进行色谱分离，色谱条件同“2.3”项；LC-Q-TOF-MS系统，采用电喷雾离子源(ESI)进行正(PI)、负离子(NI)模式全扫描，扫描范围m/z50～1 500；喷雾电压4.5 kV，离子源温度500 ℃，去簇电压100 V，气帘气压(N2)：35 psi，雾化气压(N2)：55 psi，辅助气压(N2)：60 psi。

应用LC-Q-TOF-MS技术，按上述色谱分离条件及质谱条件，对白及指纹图谱中7个特征峰进行分析，结果见表2所示。利用Agilent Mass Hunter version B.0400软件对总离子流图中的准分子离子峰进行提取，色谱峰2、9利用化学对照品比对；其余化合物利用精确相对分子质量、二级碎片信息和文献报道比对[13]进行初步鉴定。结果显示特征峰按化学结构分为葡糖糖苷类：色谱峰2(4-羟甲基苯基-葡萄糖苷，gastrodin)；苄酯类：色谱峰4(4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯，blestroside)、色谱峰9(1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯，militarine)、色谱峰11(1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-(4-O-肉桂酰基)葡萄糖苷，gymnoside Ⅴ)；菲类：色谱峰12(3，5-二羟基-1-甲氧基-9，10二氢菲，coelonin)、色谱峰14(苄基氢菲3，benzylhydrophenanthrene 3)、色谱峰13(4-甲氧基菲-2，7-二醇，4-methoxyphenanthrene-2，7-diol)。

2.8 多元统计分析

为更加客观、直接的阐明不同采集时间白及次生代谢产物的差异性，利用SIMCA-P软件进行PCA、PLS-DA分析，其得分图可以提供可视化的白及样品分类情况，载荷图能够直观的分析对白及样品分类起主要作用的变量信息。将白及24个采集时间点的HPLC指纹图谱共有峰峰面积导入SIMCA-P 11.5软件，经归一化处理后进行PCA分析，结果见图3。由图3可知，不同采集时间白及样品Class1、Class2与Class3和Class4区分良好，但Class3和Class4难以达到有效区分，表明不同采集时间白及次生代谢产物存在差异。其中Class1样品(S1～S6，冬季)和Class2(S7～S12，春季)分布在得分图左侧，t[1]象限负值区域，说明冬、秋两季白及样品次生代谢产物与夏、秋两季差异明显；Class3样品(S13～S18，夏季)和Class4(S19～S24，秋季)分布在得分图右侧，t[1]象限正值区域，但夏季和秋季白及样品彼此交叉，未能达到有效区分，说明夏、秋两季白及样品内次生代谢产物差异不明显。

表2 特征色谱峰初步定性结果

图3 同采集时间白及样品PCA得分图Fig.3 Scores plot of PCA of Bletilla striata samples

为明确不同采集时间白及样品次生代谢产物的差异性化学成分，缩小组内差异，进一步采用有监督模式的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，建立不同采集时间白及分类模型。由PLS-DA得分图，由图4A可知，Class1样品(S1～S6，冬季)分布在最右侧，t[1]象限正值和t[2]象限负值所组成的区域内；Class2(S7～S12，春季)分布在得分图右侧，t[1]象限正值与t[2]象限正值所组成的区域内，Class1和Class2以及与其他样品区分效果较好，说明Class1和Class2之间以及与其他分类样品中次生代谢产物差异明显；Class3和Class4分布在得分图左侧，t[1]象限负值区域，同样彼此交叉，未能实现有效区分，说明Class3和Class4次生代谢产物差异不明显。

图4 不同采集时间白及样品PLS-DA得分图(A)和载荷图(B)Fig.4 Scores plot of PLS-DA and Loading plot of PLS-DA of Bletilla striata samples

由载荷图4B可知，在t[1]方向，变量色谱峰2(gastrodin)、11(gymnoside Ⅴ)对样品向t[1]正值方向分布起到积极作用，说明色谱峰2、11由t[1]正值向负值方向其峰面积有不断变小的趋势；而变量色谱峰12(coelonin)、13(4-甲氧基菲-2，7-二醇)、14(苄基氢菲3)对样品向t[1]负值方向分布起到积极作用，其峰面积由t[1]正值向负值方向其峰面积有不断变大的趋势，与GAS含量分析结果一致。在t[2]方向，变量4(blestroside)、9(militarine)对样品向t[2]正值方向分布起到积极作用，是引起样品在t[2]方向分散的主要变量。有图4B可见，Class3和Class4分布相互交叉，区分效果不明显，表明上述变量在Class3和Class4两类中差异不明显，这与《中国药典》记载白及夏、秋季节采集的要求[1]相一致。综上，白及样品在由冬季-春季-夏、秋季生长过程中菲类化合物(4-甲氧基菲-2，7-二醇、benzylhydrophenanthrene 3、coelonin)的含量有不断增加的趋势；糖苷类化合物(gastrodin)及苄酯类化合物(gymnoside Ⅴ)的含量则不断变小的趋势，在冬、春季含量高；苄酯类化合物(blestroside、militarine)的含量有不断升高的趋势，在夏、秋季含量最高。

所建立PLS-DA模型的R2X=0.936，R2Y=0.851，Q2=0.828，表明模型稳定，预测能力强。上述变量色谱峰2(gastrodin)、11(gymnoside Ⅴ)、12(coelonin)、13(4-甲氧基菲-2，7-二醇)、14(benzylhydrophenanthrene 3)、4(blestroside)、9(militarine)的Variable Important Plot(VIP)值均大于1，根据变量VIP值大于1作为特征变量的原则，上述7个变量可作为白及在不同采集时期重要特征变量以及不同采集时期的主要差异化学成分，这些差异性化学成分为不同采集时期白及内在质量差异的物质基础。

3 讨论

众所周知，药用植物次生代谢产物是药效发挥的主要物质载体，积极探索并阐明药材在不同采收时间次生代谢产物累积差异及药材质量的形成规律具有重要意义。因此，针对白及栽培品不同采收时期样品建立HPLC指纹图谱，按采收季节对样品进行分类，结合化学计量学分析方法，发现不同采收期样品在PCA、PLS-DA分类中Class1样品、Class2样品与夏、秋两季样品能有效区分；而Class3和Class4样品彼此交叉严重，难以获得有效区分，说明7个特征变量成分在夏、秋两季差异不如与春、冬两季明显。需要说明的是利用二极管阵列检测器同时检测254、270、285 nm指纹图谱，254、270 nm下无监督PCA分类模式难以将不同季节样品进行有效区分，故本文采用285 nm建立指纹图谱。7个特征变量中色谱峰2、11、12、13和14对样品在不同季节分布影响显著；变量色谱峰4和9主要是引起样品在t[2]方向分散的主要特征变量。有文献报道在大鼠血清中检测到MIL、GAS和blestroside原型产物[14,15]，说明这些入血成分与不同临床药效可能存在一定的相关性。

本研究采用HPLC技术建立化学指纹图谱，结合化学计量学方法得到7个特征变量，并利用LC-HRMS联用技术初步鉴定了7个特征变量，阐明了不同采收时期白及差异性化学物质基础，并初步理清了7个特征化学成分在不同季节含量的变化趋势，其结果与《中国药典》中描述的夏、秋季采集相一致，在一定程度上验证了夏、秋季采集的合理性；随着白及次生代谢产物不断被发现以及这些单体化合物在抗肿瘤、抗炎、抗菌等方面的作用不断被阐明，根据7个特征化学成分动态变化规律以及临床治疗目的，提高这些药效成分在白及药材中的含量，保证临床用药效果，为更加科学的控制采收时期和合理的制订白及药材质量标准提供理论依据和参考。