PCR 实时荧光检测在孕妇B族链球菌感染中的意义

毛颖佳，李连友，于浩，王晓红

(内蒙古自治区赤峰市医院检验科，内蒙古自治区 赤峰)

0 引言

B族链球菌（group B streptococcus，GBS）是兼性厌氧革兰氏阳性链球菌，为条件致病菌,寄生于人类下消化道、泌尿生殖道，是围产期母婴感染的主要致病菌之一[1]。国外研究报道，非洲孕妇带菌率最高，约22.4%，美洲为19.7%、欧洲为19%[2]。国内研究发现，孕妇GBS带菌率约10.1%～32.4%[3]。GBS 生殖道感染对孕妇及新生儿的危害性大，可引起胎膜早破、早产、和新生儿感染等[4]。本研究通过应用细菌培养法及GBS DNA PCR 实时荧光检测法对孕28-36周孕妇进行GBS检测，研究GBS带菌对妊娠结局的影响及PCR实时荧光检测方法在GBS检测中的应用价值。

1 对象与方法

1.1研究对象

2018 年1月至2019 年1 月来我院产科产检的孕妇行 B 族链球菌感染检测的孕妇1852例， 孕妇年龄 19-42岁;初产妇912例，经产妇 940例;孕周为 28-36w。所有孕妇孕周均经末次月经、早中孕期B超检查进行确认和核对，近期无性交及抗生素应用史。

1.2方法

1.2.1 取材

根据2010年美国疾病预防控制中心推荐的取材方法[5]，擦去外阴的分泌物，用一根无菌阴道棉拭子放入阴道下1/3旋转一周取阴道分泌物，另外一根棉拭子插入肛门，在肛门括约肌上2-3cm处轻旋得直肠分泌物。每例孕妇用两根拭子取材作为一份标本，每例孕妇采集两份标本分别进行GBS培养及GBS DNA PCR 实时荧光检测。

1.2.2 研究方法

（1）GBS培养：将每份标本接种到 5% 羊血脂平板，置5%CO2环境中培养24 ～48 h，挑取β溶血的可疑菌落进行纯培养后，做涂片进行革兰染色镜检，镜下形态为革兰阳性球菌，呈链状排列，触酶试验阴性确定为链球菌属，GBS阳性。

（2）GBS DNA 检测：采用PCR实时荧光定量技术检测 GBS DNA，试剂盒采购来自北京博尔诚有限公司，使用仪器为美国Bio-Rad 公司产品（实时荧光定量核酸扩增仪C1000型），检测体系及判读方法按照试剂盒说明书进行。

（3）观察指标：以GBS培养作为金标准，计算 GBS DNA 检测的灵敏性和特异性，根据相关数据探讨孕妇GBS阳性率与妊娠结局及其所生新生儿的结局。

1.3统计学方法

2 结果

2.1 GBS培养阳性孕妇共156例，阳性率为8.42%（156/1852），以 GBS 培养为金标准，计算出GBS DNA 检测的灵敏性为 93.4%（156/167），特异性为99.3%（1673/1685），阳性预测值为 92.9%（156/168）和阴性预测值为99.3%（1673/1684）。见表 1。

表1 GBS培养和GBS DNA 检测的灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值

2.2 GBS培养阳性孕妇共156例做为实验组，选取同时期GBS培养阴性孕妇156例做为对照组，比较两组的妊娠结局及新生儿结局，结果显示GBS阳性组在剖宫产率、产后出血、胎膜早破、新生儿GBS感染率及新生儿黄疸发生率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2及表3。

表2 GBS阳性孕妇与GBS阴性孕妇妊娠结局比较（例/%）

表3 GBS阳性孕妇与GBS阴性孕妇的新生儿结局比较（例/%）

3 讨论

GBS 是革兰氏阳性球菌，为围产期母婴感染的主要致病菌之一。孕妇GBS带菌率因国家、 地区、人种不同而不同。国外研究报道，非洲带菌率最高，约22.4%，美洲19.7%、欧洲19%[6]。国内研究发现，孕妇GBS带菌率约10.1%～32.4%[3]。本研究结果显示孕妇GBS带菌率为8.42%，本研究孕妇GBS带菌率在年龄、产次、流产史等两组差异均无统计学意义。国外有研究发现35-37周妊娠晚期孕妇GBS带菌率在初产妇明显高于经产妇，差异有统计学意义[7]。国内外研究均证明，孕妇GBS感染可引起磷酸酯酶A2、前列腺素、细胞因子等的释放，刺激子宫收缩，导致早产[8]。我国早产发生率约7%～8%，本研究GBS阳性孕妇组早产发生率为7.69%，GBS阴性组发生率为3.85%，提示GBS阳性孕妇组与GBS阴性组在早产上差异无统计学意义，可能与病例数少有关，有待进一步研究。GBS寄生于下消化道、泌尿道、阴道、宫颈，上行性感染胎膜，通过炎症细胞吞噬作用、细菌磷酸酯酶A2的直接侵袭，使局部胎膜张力减低，导致孕妇在分娩前或分娩时发生胎膜早破现象[9]。GBS感染后细胞角蛋白表达下降并发生功能障碍，羊膜上皮细胞中间纤维网架发生扰动，导致细胞膜完整性被破坏，影响组织抗拉强度，这表明了孕妇GBS感染与胎膜早破的感染密切相关[10]。本研究结果显示GBS阳性组胎膜早破发生率为26.28%，GBS阴性组发生率为11.54%，GBS阳性组胎膜早破发生率明显高于GBS阴性组。B组链球菌病（GBS）是新生儿出生后第一周最常见的感染性疾病。新生儿感染GBS的发病率和死亡率显著高于正常新生儿，GBS病是影响新生儿败血症、脑膜炎和肺炎的重要因素。在台湾，孕妇在产道携带GBS的患病率约为20%，GBS相关疾病的新生儿发病率约为0.1%，GBS相关疾病的新生儿死亡率在10%至13%之间，与GBS感染相关神经后遗症的患病率为15%[11]。本研究结果显示GBS阳性组新生儿GBS感染率高于对照组，与国内外研究相符，证实了GBS定植对孕产妇及新生儿均可造成不良影响。因此，临床应当尤其重视GBS的筛查，将GBS筛查作为常规项目，普及GBS筛查，尽早进行预防，避免不良妊娠结局的发生，减少GBS相关疾病的发生。

GBS检测方法主要有免疫学、培养法和PCR法[12]。免疫学法既可检测抗原，也可检测抗体，检测迅速，但因其敏感性和特异性稍低，近年来临床应用逐渐减少。培养法一直被认为是诊断的金标准，但其培养难度高，灵敏度有限，假阴性率高，漏诊率高，且耗时长，因此在临床检测中造成一定的局限性[13]。近年来，PCR实时荧光检测技术的应用越来越多，其具有快速、准确、实时等优点，PCR法是一种快速且高效的病原微生物检测的方法，可通过对不同种属特异性核算序列设计引物及不同荧光染料标记探针的应用，在高通量检测仪器的辅助下完成具有快速性、 敏感性且高通量性的闭盖检测，具有检测结果准确可靠、敏感性高的优势[14-15]。应用 PCR 法进行GBS检测时，最短30分钟即可获得结果，检出时间可控制在6小时内，耗时明显低于细菌培养法，因而更具临床实践意义[16-17]。本文通过研究发现，PCR方法诊断 GBS 的灵敏性为93.4%（156/167），特异性为99.3%（1673/1685），阳性预测值为92.9%（156/168）和阴性预测值为99.3%（1673/1684），与国内研究一致[16]，提示实时荧光定量 PCR 对于 GBS 具有非常好的诊断效能，可及时、准确的对GBS进行诊断。因此，PCR 技术适用于孕妇GBS的筛查。孕妇GBS带菌的相关危险因素因国家地区不同而不同，因此需要进行彻底的评估，选择最适当的预防策略[19]。我国尚缺乏GBS感染的临床流行病学研究，进一步的流行病学调查工作应在不同地区进行，从而明确实际孕妇GBS带菌率、危险因素及GBS与孕妇、新生儿的相关性，从而制定常规 GBS 筛检和有效预防治疗措施，以防止潜在的母婴不良结局发生的可能性。