扶正祛痰丸治疗支气管哮喘患者对外周血Th17/Treg细胞因子的影响

徐建升

(东营市东城医院，山东 东营）

0 引言

现代研究认为，支气管哮喘是一种慢性呼吸道的炎症，致病原因是由于T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等多种细胞因子参与的顽固性呼吸道疾病[1]，临床症状以气道高反应性，气道气流受限为主要特征，表现为喘息、胸闷、气急和咳嗽等。西医传统理论认为支气管哮喘的免疫学发病机理和辅助性T细胞的Th1、Th2细胞亚群之间比例失衡是有关[2]，随着近几年的研究很多学者发现哮喘患者痰液中检查出了数量很多的中性粒细胞，Th1/Th2失衡论已经不能很完整的解释这一现象[3]。TH17细胞是新发现的CD4+T亚细胞群，现在研究已经证实，哮喘患者发病过程中，Th17细胞分泌的IL-17数量明显增多，而Treg细胞（调节性T细胞）表达的转录因子叉头蛋白3反而减少明显，导致Th17/Treg比例失衡，能够调节免疫反应，使哮喘的病机得到进一步的补充，对临床治疗支气管哮喘的疗效观察有了更完善的指导。

中医认为，哮病发病的根本病因是“肺脾虚弱，肾气不足”，发病的外邪主要是“夹痰、夹瘀及气逆”等原因。中医药治疗支气管哮喘，能够控制哮喘发作的次数以及在发病程度上都会有很大的改善，从而提高患者生活质量。笔者在从事临床中医过程中，立足前人“未病先防，既病防变”的宗旨，以“补益脾胃、固护肾阳”为基础的治疗法则，配伍中更加重视祛痰、理气以治标，采用“扶正祛痰”为立方原则，对支气管哮喘进行干预，通过本实验以Th17/Treg为出发点，观察其在临床治疗支气管哮喘的临床疗效，为其推广应用提供现代科学依据。报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择我院中医科支气管哮喘患者66例，诊疗时间源于2016年12月至2018年5月期间门诊患者，年龄阶段在6岁—70岁之间，病程1～15年之间；随机抽取男女，所取病例都达到支气管哮喘缓解期的中西医诊断标准。中医症候属哮病缓解期肺、脾、肾三虚夹杂痰郁气逆型。无接受任何激素和免疫治疗者；依从性好，能够配合本次研究者。排除哮喘合并支气管扩张、慢阻肺等慢性呼吸道疾病患者；类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等慢性免疫炎症性疾病患者；并且合并严重心、肝、肾功能不全者；精神异常者。

1.2 研究方法

1.2.1 配方如下

僵蚕90g、蝉蜕90g、五味子180g、炒杏仁90g清半夏90g、 防风90g、代赭石120g、黄芪180g、紫石英180g、白术120g、茯苓120g、麻黄90g、桔梗90g、厚朴120g、胆南星90g、甘草60g。以上诸药按照水煎法要求久煎两遍，分阶段分别用武火、文火等慢慢将所提取的药液浓缩至流浸膏，再按照流浸膏制造浓缩丸的制造要求将药品制成1000丸分瓶储存。由东营市东城医院制剂室承担。

1.2.2 配制中药浓度

取配方中药制好的的流浸膏浓缩丸适量，用二甲基亚砜(DMSO)将中药丸稀释并做成0.1mmol/L浓度的液态状备用。

1.2.3 主要试剂

人IL-25试剂盒、人IL-17试剂盒、、人IL-35试剂盒、人IL-10试剂盒；24孔培养板；青蒿素（Art纯度98%）；RPMI-1640完全培养液；DMSO；人外周血中淋细胞的分离液巴；淋巴细胞刺激剂。

1.2.4 主要设备

超净工作台；-80℃冰箱；加液枪；自动双重纯水蒸馏器；CO2培养箱（；TDZ5-W5型号多管架自动平衡离心机。

1.2.5 采集标本与分离淋巴细胞

1）准备真空采血肝素锂真空抗凝管6组，并分别标识健康人、哮喘急性期、哮喘缓解期，三组人员清晨空腹于肘窝采外周静脉血，分别按组将采集血存于肝素真空抗凝管内。

2）将配好的0.1mmol/L浓度的液态中药治疗液用RPMI-1640培养液稀释成0.16umol/mL的浓度比。

3）首先采集入选者的外周静脉血，根据密度梯度离心的方法，先将抽取的外周血液配制成PBMCs液，然后根据实验需求全部用RPMI-1640培养液把PBMCs液调配成密度是2×107个/mL的实验用血，将入选的三组哮喘患者的PBMCs每组都分别分成2组，共6组，将他们分别加入每一组是24孔培养板内，缓解期、急性期哮喘患者标本的PBMCs分别放两个孔，再将1m L的PBMCs液注进每个孔内，在健康组每个孔中注入2ul的细胞刺激剂和10ul的RPMI-1640培养液，在缓解期与急性期哮喘患者两个孔中都加入细胞刺激剂2ul、分别加入扶正祛痰丸(0.16umol/m L)10ul和RPMI164培养液10ul。

4）将加入了患者血样标本的培养板全放进孵箱中，按照要求将温度设为37℃，内含有5%CO2，继续将样本培养24小时后，再将培养板孔中PBMCs液收集起来，并分别标注好，放进备好的相对应的空管内，用转速为3000 r/分的离心机，快速离心20，标本的上面会分离出清亮液体，将清亮液体注进1.5m LEP管内，保存在零下80℃的冰箱中备用。

1.2.6 检测炎症细胞因子

1）将保存在-80℃冰箱里的PBMCs上清液标本解冻，并按照酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒上的要求操作，慢慢恢复常温。

2）将所有标本在420nm的吸光光度仪上进行OD值检测；

3）根据试剂要求，用ELISA软件包统计出各组IL-10、IL-17、IL-25、IL-35炎症因子的浓度水平，对数据进行分析，最后得出结果。

1.2.7 统计学方法

采用 SPSS 18.0 软件包对实验所得数据进行的统计学处理，计量资料数据在满足正态分布和方差齐性的前提下，以均数±标准差s）论述，技术资料检验用χ2表示，当P＜0.05 时认为有统计学意义，组间外比较使用单因数方差分析(ANOVA)，组间内采用 LSD-t 检验进行分析比较。

2 结果

2.1 入选者一般情况

根据三组患者的临床资料进行对比，情况见下列表1。

表1 三组患者一般情况

2.2 健康对照组，急性期、缓解期哮喘患者发病和在治疗后在实验所得外周血清Th17/Treg细胞分泌的炎症因子浓度分析对比，情况见表2

表2 健康组和扶正祛痰丸对两组支气管哮喘血清中细胞因子Th17/Treg结果比较分析(±s )(pg/mL)

Th17细胞在1640干预时分泌的IL-17、IL-25细胞因子在缓解期和急性发作期组的浓度比健康组的值升高(P＜0.05)，细胞因子浓度升高在急性期组较其他两组更显著(P＜0.05)；IL-10、IL-35细胞因子浓度比正值在缓解期和急性加重期比正常组低，降低也更明显（P＜0.05)。经扶正祛痰丸治疗后，缓解期与急性发作组中Th17细胞分泌的IL-17、IL-25细胞因子的浓度降低(P＜0.05)，急性发作期组中IL-17、IL-25的浓度水平比缓解期组数据降低的幅度更大(P＜0.05)；经1640干预的Treg细胞分泌的IL-10、IL-35的浓度比哮喘急性发作期组、哮喘缓解期组测得浓度比数据结果都明显升高(P＜0.05)(见表2）。

3 分析与讨论

支气管哮喘是患者特禀体质造成自身免疫失衡的一种疾病，在各种内外因素的结合下，Th细胞容易出现漂移，不同的Th亚群能够分泌独特的细胞因子影响着患者的气道炎症哮喘的发病与炎症反应有密切关系。自人们首次发现新型细胞亚群—Th17细胞以来，众多学者对其在疾病治疗以及其与调节性T细胞的关系进行了研究，已经证实Treg细胞和Th17细胞与支气管哮喘发病有密切的关系。Th17/Treg细胞失衡学说成为继Th1/Th2失衡之后对支气管哮喘更新的诠释。Th17细胞在促进自身免疫反应中能够发挥重要作用，并参与了感染性疾病和自身免疫疾病.IL-25、IL-27、IL-35等对Th17细胞有抑制作用。IL-17是一种促炎因子，更是Th17细胞重要的效应因子,是在体内备受关注的受体，在哮喘患者中都检测到了IL-17的明显表达。Treg细胞是具有免疫调节作用的专门的抑制细胞，是重要的调节呼吸道炎症的内院细胞。在免疫反应中能够保护和避免机体过度反应，也能够利用抑制炎症细胞的释放改善对组织的损伤，在自身免疫中地位很重要，能够调节呼吸道黏膜吸入抗原产生耐受，能够减少气道EOS减弱气道的炎症，从而产生哮喘。有研究表明在哮喘患者外周血中，Treg细胞的功能下降，数量和分泌的细胞因子水平也减少。

中医对支气管哮喘急性期的传统治疗以宣肺理气、祛风化痰为主，缓解期的治疗重点在于扶正固本。很多医家在治疗支气管哮喘急性发作期时，不兼顾患者素虚的体质，缓解期的治疗认识不到祛伏痰、理气滞的重要性，所以在临床对该病的治疗效果并不理想。扶正祛痰丸立方原则既重视患者素虚的体质，又考虑邪气存内是诱发的重要外因，选用即能扶正纳气，又能祛风化痰的中药组方，故而取得了更好的疗效。扶正祛痰丸的药物组成是由具有健脾补肺益肾之功、有祛痰理气之效、祛风解痉之力和巧妙的运用具有宣肺平喘作用的中药组成。方子祛痰理气为主也是筛选了具有辅助肾气作用的治咳平喘的作用的中药，所以是一个具有见效快、治病求本的治喘方剂。辩证上即重视肺、脾、肾三脏的亏虚，通过扶助正气以杜绝痰的生成，治疗上在各期都配伍了具有祛风、化痰、降气作用的中药，消除呼吸道内久伏之顽风老痰，达到邪已祛，正气复，病情尽量做到少复发。

支气管哮喘是有多种炎性细胞引起的呼吸道的高敏感性和气道狭窄的呼吸道疾病，往往由于痰阻于肺道引起气逆而致的喘息、呼吸困难、胸闷、咳嗽等呼吸道症状。治疗支气管哮喘祛痰的必要性在“百病皆由痰做崇”之说就能体现出来，故“欲治咳喘者，当以治痰为先”。扶正祛痰丸具有固气摄纳、宣肺平喘和祛痰理气的特点。哮喘内存之顽痰只有倾其药物全力，才有可能彻底的祛邪外出。扶正祛痰丸中的药物成分经过多次临床研究证实即能够起到很好的祛痰止咳平喘的作用，又能够提高机体免疫能力，增强人体抗过敏的作用，取得了很好的临床疗效。