板栗腐烂病小刺青霉菌(Penicillium spinulosum)培养条件及药剂筛选

王俊凤，温晓蕾，孙伟明，刘一健，时路亭，张娜娜，杨文杰，陈卫东，齐慧霞*

(1.河北科技师范学院农学与生物科技学院，河北 秦皇岛 066600；2.河北大学生命科学学院，河北 保定071002；3.河北省唐山市迁西县林业局，河北 唐山 064300)

中国各地区都有板栗分布，在我国栽培面积广泛，面积达180万hm2，总产量195万t，是世界上主要生产国之一[1]。随着板栗种植面积不断扩大，生长期和贮藏期病害种类都有逐年增加的趋势。在贮藏过程中，板栗怕干、怕水、怕闷、怕热、怕冻[2]，从而造成贮藏期板栗易失水、霉变、病变等[3]，造成贮藏期板栗果仁腐烂。引起栗果腐烂的病菌如链格菌、镰刀菌、青霉菌[4]等已有报道，发病初期栗仁上出现各种坏死斑点，严重时发生霉变，有黑斑、褐斑和腐烂三种类型[5]。青霉菌引起的青霉病和种仁斑点病造成腐烂中的湿腐[5]。青霉菌属广泛分布于板栗主产区的腐烂栗实中[6],已报道的有皮落青霉、波兰青霉、鲜绿青霉、光孢青霉、意大利青霉、指状青霉、小刺青霉、草酸青霉等[7-8]。本文对引起栗果腐烂的小刺青霉菌的适宜生长条件以及对其敏感药剂进行了研究，旨在找出控制该病害的有效措施，为板栗产业健康发展助力。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株由河北科技师范学院植物保护实验室提供。

1.2 培养基的配制

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、水 1 000 mL、琼脂粉20 g。

燕麦培养基：燕麦30 g、琼脂20 g、水 1 000 mL。

板栗培养基：去皮板栗200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、水1 000 mL。

察氏培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g、硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g 硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂粉20 g、水1 000 mL。

1.3 病菌培养条件筛选

1.3.1培养基对病菌 用5 mm的打孔器在PDA培养基上取菌饼，分别接种到PDA、燕麦、板栗、察氏培养基上，25 ℃黑暗条件下培养，每处理重复3次，7 d后采用十字交叉法测量菌落直径，12 d后用血球计数板在显微镜下测其产孢量。

1.3.2不同氮源对病菌的影响 将察氏培养基中的硝酸钠分别用等量酵母浸粉、蛋白胨、硫酸铵、牛肉膏、氯化铵、硝酸钾代替，以无硝酸钠的察氏培养基作为对照，每处理重复3次，测定菌落直径和产孢量。

1.3.3不同碳源对病菌的影响 将察氏培养基中的蔗糖分别用等量可溶性淀粉、木糖醇、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇代替，以无蔗糖的察氏培养基作为对照。每处理重复3次，测定菌落直径和产孢量。

1.3.4不同光照对病菌的影响 用5 mm的打孔器取小刺青霉的菌饼接种于PDA培养基上，分别在25 ℃黑暗，光照/黑暗交替培养箱中培养，每处理重复3次，测定菌落直径和产孢量。

1.3.5不同温度对病菌的影响 取小刺青霉菌菌饼接种在PDA培养基上，培养温度分别为5、10、15、20、25、30、35 ℃，每处理重复3次，7 d后采用十字交叉法测量其菌落直径。

1.3.6不同pH对病菌的影响 用NaOH和HCl溶液把PDA培养基的pH分别调至4、5、6、7、8、9、10、11，取小刺青霉菌菌饼接种于平板上，在25 ℃恒温箱中培养， 7 d后采用十字交叉法测量其菌落直径，每处理重复3次。

1.4 杀菌剂室内毒力测定

1.4.1供试药剂 24%噻呋酰胺SC(美国陶氏益农公司)、40%氟硅唑EC[兴农药业(中国)有限公司]、80%多菌灵WP(河北冠龙农化有限公司)、45%咪鲜胺EW(河北冠龙农化有限公司)、25%丙环唑EC(永农生物科学有限公司)、50%咯菌腈WP[先正达(中国)投资有限公司]

1.4.26种杀菌剂室内毒力测定 采用菌丝生长速率法[9]测定杀菌剂对小刺青霉菌的毒力。每种杀菌剂设置5个梯度，每梯度重复3次。用灭菌的打孔器取直径5 mm的菌饼分别倒置在含不同药剂和不同浓度的平板(包含作为对照的不含药平板)中央，在25 ℃恒温培养箱黑暗条件培养8 d，采用十字交叉法测量菌落直径[10]，计算菌丝生长抑制率[12]。然后把菌丝生长抑制率换算成机率值(y)，药剂浓度转换以10为底的对数值，用DPS求出毒力回归方程y=ax+b，有效抑制中浓度(EC50)及相关系数[11]。

抑菌率=[(对照菌落直径(mm)-处理菌落直径(mm)/对照菌落直径(mm)-5 mm]×100%

2 结果与分析

2.1 培养基对小刺青霉菌生长和产孢的影响

小刺青霉菌在4种不同培养基上生长状态如表1所示，发现其在燕麦、板栗、PDA、察氏4种培养基上均能生长，板栗培养基最适宜其生长，7 d菌落直径达3.72 cm，其次为燕麦培养基，菌落直径为3.50 cm。PDA培养基与察氏培养基不适宜菌丝生长，7 d菌落直径仅为2.50 cm左右，但却最适合其产孢，其产孢量分别为2.40×108和1.70×108cell·L-1。由此可见，板栗培养基适宜该菌的生长，PDA培养基更有利于该菌的产孢。

表1 培养基对小刺青霉菌生长的影响Table 1 Effects of medium on growth of Penicillium spinulosum

2.2 氮源对小刺青霉菌生长和产孢的影响

由表2可知，酵母浸粉为该菌菌丝生长适宜的氮源，培养7 d后，菌落直径达3.42 cm,其次是硝酸钠，菌落直径为2.87 cm，而供试氮源培养基中以硝酸钾为培养基的菌丝生长最慢，菌落直径为1.80 cm。在产孢方面，以酵母浸粉处理产孢最多，为2.93×108cell·L-1，硝酸钾处理产孢最少，为0.23×108cell·L-1。由此说明，酵母浸粉为氮源有利于菌丝生长和产孢。

表2 氮源对小刺青霉菌生长的影响Table 2 Effects of nitrogen source on growth of Penicillium spinulosum

2.3 碳源对小刺青霉菌生长和产孢的影响

由表3可知，小刺青霉病菌在供试碳源中以可溶性淀粉和木糖醇利用率更高。培养7 d后，菌落直径分别为3.35和3.28 cm，甘露醇不适宜其菌丝生长，但适宜其产孢，产孢量为1.97×108cell·L-1。

表3 碳源对小刺青霉菌菌丝生长和产孢的影响Table 3 Effects of carbon source on growth of Penicillium spinulosum

2.4 光照对小刺青霉菌生长和产孢的影响

由表4可知，在3种不同培养条件下，小刺青霉病菌均能生长，其中以全黑暗条件下生长最快，菌落直径达4.35 cm。在全光照和黑暗交替条件下，菌落直径差异不显著。3种不同环境下，该菌的产孢量不存在差异性。说明全黑暗利于该菌菌丝的生长，在任何条件下都能产孢。

表4 光照对小刺青霉病菌生长的影响Table 4 Effects of light on growth of Penicillium spinulosum

2.5 不同温度、pH对小刺青霉菌生长的影响

由图1可知，小刺青霉病菌在温度5～30 ℃条件下均能生长，在15～30 ℃温度范围内生长最快，其中以20 ℃为最适生长温度，菌落直径为2.90 cm，35 ℃条件下停止生长；小刺青病菌在pH 4～11 PDA培养基上均能生长，其中适宜生长的pH为7，菌落直径为2.82 cm。

2.6 6种杀菌剂对小刺青霉菌的毒力分析

由表5可知，供试杀菌剂对小刺青霉菌菌丝的生长均有抑制作用。其中以40%氟硅唑抑制效果最好，EC50为0.007 8 mg·L-1；45%咪鲜胺EW和80%多菌灵抑制效果也较好，EC50分别为0.058 8、0.065 0 mg·L-1；而24%噻呋酰胺抑制效果相对较差，EC50为4.732 3 mg·L-1。

注：图中不同小写字母分别表示在P< 0.05水平差异具有统计学意义。Note：Different lowcause letters in the figure indicate significant difference at P<0.05 level.图1 温度和pH对菌丝生长的影响Fig 1 Effects of temperature and pH on mycelium growth

表5 供试杀菌剂对小刺青霉菌毒力结果Table 5 Test results of virulence test of test fungicide against Penicillium spinulosum

3 讨论

青霉菌对植物的危害已引起各界人士广泛关注。闵晓芳[13]指出产黄青霉和扩展青霉菌丝生长适宜温度为25 ℃，光照条件对菌丝体生长无差异。杜奕君等[14]指出草酸青霉适宜生长温度为30 ℃。陶能国等[15]指出指状青霉和意大利青霉菌丝生长适宜温度为25 ℃，适宜pH为7。与小刺青霉菌生长环境略有不同。小刺青霉菌在板栗培养基上生长最快，但产孢量在PDA培养基上最多，生长温度在5～30 ℃之间，最适温度为20 ℃；pH为4～11时均能生长，最适pH为7，喜黑暗环境。不同碳源和氮源对其菌丝的影响，碳源以可溶性淀粉为培养基最适宜菌丝生长，而适宜产孢的碳源为甘露醇；氮源以酵母浸粉为培养基，菌丝生长最快同时产孢最多。

赵建江等[16]明确了氟硅唑与代森锰锌混配对梨黑星病有较好防效；刘霞等[17]分析了咪鲜胺、戊唑醇和三唑酮对核桃炭疽病菌丝有较强的抑制作用；唐光辉[18]探究出戊唑醇注干杀菌剂对板栗疫病的防治效果最佳。而本文针对小刺青霉病菌进行的室内药效试验，结果表明：室内毒力测定的噻呋酰胺、丙环唑、咪鲜胺、咯菌腈、氟硅唑、多菌灵等几种杀菌剂中以40%氟硅唑EC对小刺青霉病菌菌丝的抑制效果做好，EC50为0.007 8 mg·L-1；其次为45%咪鲜胺EW和80%多菌灵WP，EC50分别为0.058 8和0.065 0 mg·L-1，24%噻呋酰胺SC抑制效果最差，EC50为4.732 3 mg·L-1。对板栗小刺青霉病菌抑菌效果较好的单剂、复配剂以及生物制剂还有待于进一步研究。