LPS联合烟熏致COPD大鼠模型的证候判定＊

王智超，吴雨潇，王振兴，刘丽耘，张 秀，李 光，王 飞＊＊

（1. 成都中医药大学临床医学院 成都 610075；2. 成都中医药大学国际教育学院 成都 610075；3. 曲靖市中医医院 曲靖 655000）

中医证候动物模型是以中医理论体系为指导，对疾病的病因和病理等重要特征进行模拟复制，同时具备西医疾病和中医证候双重特征的实验动物[1]，其关键在动物证候与人体证候的相似性[2]。证候是疾病过程中某一阶段可被观察到外在表现的概括，是不断处于动态变化中的表征集合。但是，从中医病证结合动物模型发展历史来看[3]，研究大多忽视了“疾病过程中证候演变规律”这一关键环节，严重阻碍了对疾病证候本质的研究及临床应用推广。

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持续气流受限为特征的肺系疾病，与气道和肺组织对烟草烟雾等有害气体或有害颗粒的异常慢性炎症反应密切相关，属于“肺胀”的范畴[4]。目前，以辨证论治为基础的COPD 病证结合模型存在诸多问题，严重制约着中医药防治COPD 的基础研究。例如，药物模拟的“证”与人体证候是否一致，如地塞米松磷酸钠造阴虚痰饮证[5]、腺嘌呤加SO2诱发肾不纳气证[6]；复合因素相兼不利于模型制备的稳定性、重复性，亦忽视了动物本身体质因素等问题，如多个低温因素叠加造COPD 寒饮蕴肺证[7]；证候判定中缺乏客观定量、定性化的证候宏观表征分析用以证明大鼠COPD 模型的证候归属。目前，国内外广泛使用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）联合烟熏制备COPD 疾病动物模型[8-9]，但此种动物模型缺乏明确的宏观表征分析，中医证候归属不明。

因此，本实验采用COPD 经典造模方法，以“因、脉、证、治”研究思路为出发点，同时引入宏观表征和时间概念，对大鼠宏观表征定量分析并分析COPD 动物模型的中医证候演变规律，从而完整地挖掘疾病发展过程“证”的动态变化，找到证候变化的时间窗[10]，为慢性阻塞性肺疾病的中医证候演变规律研究提供一定的参考。

1 实验材料

1.1 实验对象

SPF 级雄性SD 大鼠30 只，体重（150±10）g，购自于成都达硕实验动物有限公司，合格证号：SCXK(川)2015-030。饲养于成都中医药大学中医脏腑病证实验室动物房，室内12 h/12 h 光照/避光循环饲养，温度为（22±1）℃，房内相对湿度约40%，同时给予标准饲料和饮用水，动物福利按照国际相关实验动物法规实施。

1.2 试剂

脂多糖购自于美国Sigma 公司，香烟购自于四川中烟公司（每支香烟焦油含量14mg、Nicotine 含量1.1 mg、CO含量14 mg）。

1.3 仪器

自制烟熏箱（40*60*20 cm3），改良旷场笼具（70*70*20 cm3，底部黑色方格7*7 cm2），单反相机购自于日本Canon 公司，台式机购自于美国HP 公司，抓力测量仪器、WMT-100 Morris 水迷宫视频分析系统购自于成都泰盟公司，全自动血气分析仪购自于美国Medica公司，Eclipse Ci显微镜购自于日本Nikon公司。

2 实验方法

2.1 分组及造模

大鼠适应性喂养3 天后，通过水迷宫游泳剔除体力不达标大鼠后，按随机数表法[11]将大鼠分为空白组和模型组。采用LPS 联合烟熏法经典造模方法复制COPD 模型，造模第1 天、第15 天，气道滴注LPS 100 ul（1 µg/µl），滴注日不吸烟；空白组给予等体积生理盐水气道滴注。将大鼠放入自制烟熏箱内进行烟熏，每次持续1 小时、每天两次，共计30 天；空白组不吸烟。造模结束，采集各时段宏观表征后麻醉大鼠，行腹主动脉取血进行血气分析，随后右股动脉放血处死大鼠。

2.2 一般情况

试验期间，重点观察大鼠活动情况、对外界反应性、呼吸状况、精神状态、毛色毛质、大小便、爪色舌色、进食量、饮水量、体重等指标，记录大鼠死亡情况。

2.3 HE染色

取大鼠左侧肺脏中叶，经多聚甲醛固定48 h 后，石蜡包埋，制片（4µm 厚）；经HE 染色后，置于显微镜下观察病理改变。

2.4 呼吸频率

安静状态下，将大鼠轻柔抓起，使用相机对大鼠胸腹面进行拍摄（1 min）。导入电脑后，慢速回放计数呼吸频率。每2 周拍摄一次，共计3 次。活动后呼吸频率在游泳后进行，余步骤同上。

2.5 抓力测定

大鼠置于抓力板上，待大鼠稳定抓住抓力板时及时加力后拉，测取抓力，测量3次取平均值。

2.6 旷场试验

将大鼠置于安静、暗光的测试房内10 min 后，将大鼠放置于旷场固定一处，遥控打开相机记录数据，导入电脑后计数大鼠水平移动及直立次数。

2.7 负重力竭游泳实验

室内暗光，运用Morris 水迷宫系统进行实验。按大鼠体重10%将铅块系于大鼠腹部后，从固定位置放入水池，直至全身力竭（鼻头沉入水下持续10 s）后取出。每2周实验一次，共计3次。

2.8 舌象、爪色、腹部毛色

采用标准白色背景布裁剪后制作摄影棚，光源采用佳能闪光灯（600EX II-RT）全功率输出引闪；使用灰卡设置白平衡后，数码相机调至M 档，自动对焦，以F2.8、1/100s、ISO 100 条件采集图像，导入电脑后做色彩校正[12]处理。

2.8.1 舌象

用弯镊将其舌头轻微夹出，露出舌根拍照。导入电脑后，使用Photoshop CS6 打开图片，按照实际像素放大图片后，选取舌面全部图像，记录直方图中红色值（R）、绿色值（G）、蓝色值（B），计算出r 值（r =R/(R + G + B)，代表其红色程度。

2.8.2 爪色

用弯镊将其右侧足底轻微夹紧拍照，余步骤同2.8.1。

2.8.3 腹部毛色

充分暴露大鼠腹面后拍照，余步骤同2.8.1。选取腹部自肋弓下缘至双足部图像，记录直方图中亮度值（L），代表其毛色亮度。

2.9 舌质和舌下络脉评分

参考尹军祥等血瘀证舌象评级标准[13]，舌质：红润记0 分、红润略暗记1 分、紫暗记2 分、紫黑记3 分；舌下络脉：色红记0 分、约1/3 舌体长记1 分、<1/2 长记2分、> 1/2 记3 分、> 2/3 记4 分。将图片按实际像素裁剪后分别交由2位实验员盲法打分，取平均值。

图1 大鼠肺组织HE染色（×200）

2.10 统计方法

3 结果

3.1 一般情况

空白组：大鼠动作敏捷、对外界刺激做出敏感反应、无明显扎堆现象；呼吸平稳、无气促；精神状态良好、皮毛光泽白亮、无脱毛；便质柔软成型、小便清亮且量适中；进食量适中。

模型组：第一次滴注联合烟熏后，大鼠反应性降低、抵抗抓力下降、出现扎推现象；呼吸气促、精神变差，皮毛无光、出现少量脱毛；大便偏干、小便色黄；食量减少。第二次滴注联合烟熏结束后，大鼠出现明显迟钝、对外界刺激无明显回应，扎堆现象明显，对灌胃抓取等无抵抗或抵抗较弱；呼吸气促、鼻翼煽动、口腔内分泌物明显增多；皮毛色暗并出现大量脱落；便干量少、小便量少色黄；进食量下降，饮水量下降。并随着造模完成后观察时间的延长，上述体征逐渐加重。

3.2 HE染色

空白组：肺泡结构正常，支气管粘膜完整，纤毛排列整齐，炎性浸润少，见图1（A）。模型组：肺组织中肺泡壁广泛可见增厚，并伴有炎性细胞浸润，支气管腔内可见较多坏死脱落的支气管上皮细胞，部分支气管上皮细胞水肿变性，细胞肿胀，胞质呈空泡状，支气管壁周围可见大量炎性细胞浸润，见图1（B）。

表1 大鼠血气分析比较（±s，n=15）

表1 大鼠血气分析比较（±s，n=15）

注：与空白组相比，*P＜0.01，**P＜0.001（以下图、表标注均同）

组别空白组模型组pH值7.40±0.02 7.36±0.04 PaO2 97.13±3.79 87.13±6.69**PaCO2 41.36±6.72 49.50±2.24*

3.3 血气分析

与空白组比较，模型组动脉血pH 值、氧分压（PaO2）均显著降低（P<0.001），二氧化碳分压（PaCO2）升高（P<0.01）。

3.4 大鼠体表宏观表征

3.4.1 体质量

脾胃亏虚则运化无力，气虚运化失常则可见动物饮食减少、体重下降，出现消瘦的表征。本次试验中，空白组体重逐步稳定增长；模型组体重增长幅度缓慢，且平均体重较空白组偏低，在第一次LPS 滴注（15天）后及造模完成（30天）后模型组体重较同时段空白组明显降低，见图2（A），P < 0.01，提示模型组大鼠出现了消瘦表征。

3.4.2 呼吸频率

COPD 稳定期患者常以喘息、气短、呼吸频率加快等症状为主，肺为气之主，肾为气之根，肺肾亏虚则大鼠可见呼吸频率加快、活动后喘息气紧等表征。空白组：大鼠呼吸频率正常且平均，活动后呼吸均匀。模型组：呼吸频率明显加快，活动后呼吸频率较空白组活动后呼吸变浅且加快（P<0.001），且与上一次呼吸频率相比，呼吸频率上升亦有统计学意义，见图2（B）、表2，P < 0.05，表明模型组大鼠出现了喘息气促等表征，且随着观察时间延长与上一次呼吸频率相比出现了明显的加快（见表2，P<0.01）。

3.4.3 抓力测定

乏力是COPD 后期常见症状，也是气虚的代表性症状，通过对大鼠肌力测定，可评价其乏力程度。本次试验中，模型组大鼠前上肢抓力较空白组下降明显，见图2（C）、表3，P<0.001，随时间推移抓力持续下降，且在造模后期（30天）抓力较前一次观测有明显下降（P<0.01），表明乏力表征在观察后期更为严重。

表2 大鼠呼吸频率表征比较（±s，n=15）

表2 大鼠呼吸频率表征比较（±s，n=15）

注：与模型组相比，▲P < 0.05，▲▲P < 0.01，▲▲▲P < 0.001（以下图、表标注均同）

呼吸频率/(次/min)安静状态下30天141.47±6.42 269.73±7.15**91.07±5.38 143.6±14.26**▲▲活动后组别空白组模型组空白组模型组1天143.13±7.69 202.73±11.01**85.13±5.11 104.47±4.64**15天142.07±6.97 228.53±25.41**85.73±9.65 112.93±7.59**▲▲

表3 大鼠抓力表征比较（±s，n=15）

表3 大鼠抓力表征比较（±s，n=15）

组别空白组模型组1天11.99±1.95 8.18±0.82**15天12.45±1.49 7.81±0.56**30天13.10±1.10 6.57±0.71**▲▲

表4 大鼠毛色亮度表征比较（±s，n=15）

表4 大鼠毛色亮度表征比较（±s，n=15）

组别空白组模型组1天183.14±6.90 170.59±3.36**15天174.00±5.54 153.54±6.32**▲▲▲30天177.51±5.97 140.86±6.60**▲▲▲

表5 大鼠活跃度表征比较（±s，n=15）

表5 大鼠活跃度表征比较（±s，n=15）

旷场试验水平移动距离直立次数组别空白组模型组空白组模型组1天14.6±1.40 10±1.51 2.6±0.83 2.07±1.33 15天16.27±1.98 8.8±1.37▲▲▲3.07±0.88 0.93±0.70▲▲30天17.2±1.78 6.8±2.04▲▲▲3±0.92 1.53±1.06▲▲

3.4.4 腹部毛色亮度值

肺在体合皮毛，皮肤毛发干枯无光是气虚血瘀临床常见症状。本次试验中，空白组大鼠腹部毛色亮度较为均一、变化小。模型组大鼠腹部毛色亮度值较空白组偏低，见图2（D）、表4，P<0.001，且亮度值逐渐下降（P<0.001）。

3.4.5 旷场试验

旷场试验是行为学实验的一部分，其主要观察动物对外界环境的适应能力、探索能力，反应动物的情绪变化，从某程度上反应大鼠活跃度及懒动状态。模型组大鼠直立次数较空白组逐渐降低，见图2（E），P<0.01，这表明大鼠对外界新环境的不敏感。水平行走距离较空白组有明显缩短，提示模型组大鼠懒动的表征，见图2（E）、表5，P<0.001。

3.4.6 负重力竭游泳实验

通过游泳时间和距离的分析，可观察动物活动耐力情况，并与抓力测定共同评价大鼠乏力程度。与空白组力竭游泳相比，模型组力竭游泳时间、距离明显缩短，见图2（G）、表6，P<0.001。随着时间推移模型组大鼠力竭游泳时间、距离逐渐下降（P < 0.01）且从游泳距离看30 天观察期较前活动距离明显下降（P <0.001），表明随着时间延长大鼠耐力下降更为明显，并与抓力实验相互印证了疾病末期气虚乏力表征的严重程度。

3.4.7 舌色、爪色

舌象是证候的关键组成部分，是中医诊断学的特色诊法，因此在动物表征的观测中舌象也是重要指征。其包括了舌色和舌底静脉长度两部分内容作为量化评分的标准。我们可以看到空白组舌色淡红而润、爪色红而有光泽；模型组舌色暗红、爪色暗红而干瘦。模型组大鼠爪色、舌色R 值明显高于空白组（P<0.001）；舌色r 比值在造模后15 天与空白组相比显著降低（P < 0.01），爪色r 比值在造模后30 天与前一次r比值降低具有统计学意义（P < 0.05），这提示在造模过程中大鼠舌色、爪色暗红，血行不畅的瘀血表征且造模后30天较前一次红色更深，表明瘀血表征在后期表现更为严重。见表7。

3.4.8舌质和舌下络脉评分

空白组舌质鲜红而润、舌下络脉清晰；模型组舌质暗红而干、舌下络脉迂曲且粗长。模型组从造模1天后舌下络脉瘀滞评分较空白组开始出现增高（P <0.01），自造模后15 天评分较空白组明显增高（P <0.001），舌质评分在造模后15 天与空白组相比升高具有统计学意义（P<0.001）。见表8、图3。

表6 大鼠力竭游泳表征比较（±s，n=15）

表6 大鼠力竭游泳表征比较（±s，n=15）

负重力竭游泳实验游泳时间/秒游泳距离/cm组别空白组模型组空白组模型组1天452.79±43.48 379.46±14.83**5621.57±648.83 4018.12±471.89**15天442.81±29.24 280.04±40.82**▲▲▲5856.73±857.84 3329.65±621.92**▲▲30天454.42±47.82 217.75±35.43**▲▲▲5925.75±588.79 2446.83±308.91**▲▲▲

图2 大鼠体表宏观表征

表7 舌色、爪色RGB比值（±s，n=15）

表7 舌色、爪色RGB比值（±s，n=15）

组别r值空白组模型组组别造模后15天132.80±9.74 105.83±5.59**造模后30天133.77±10.10 94.50±9.29**造模后1天0.55±0.02 0.54±0.01造模后15天0.56±0.02 0.53±0.02*造模后30天0.54±0.02 0.53±0.021舌色R值造模后1天138.36±6.63 120.75±5.69**爪色R值造模后1天179.19±8.805 148.16±10.604**造模后15天171.04±8.233 138.11±7.973**r值空白组模型组造模后30天174.63±7.694 126.48±8.631**造模后1天0.44±.012 0.43±.015造模后15天0.44±.014 0.44±.011造模后30天0.44±.014 0.41±.043▲

4 讨论

病证结合动物模型为疾病的证候实质研究提供了新媒介。目前，该类模型主要采用多因素造模方法模拟中医病因学发病，但是造模因素复杂、中医特色不鲜明、缺乏有效公认的定量定性观测指标、稳定性及可重复性差等问题阻碍了对证候本质研究[14-15]。因此，选用可纳入中医病因学的造模方法，采用可定量、定性分析症状、判断证候归属的四诊手段，构建与动物模型相适应的指标体系、量化标准，获取稳定、可重复构建证候模型具有重要意义。王永炎院士对此提出四诊信息所反映的整体状态是证候模型评价的标准[16]，动物表征就是模型动物的某些体表特征表现人体症状[17]，这符合中医学“视其外应，以知其内脏”的整体诊病思想，为证候模型判定提供了新思路。

表8 舌质分级评分（±s，n=15）

表8 舌质分级评分（±s，n=15）

组别空白组模型组舌质舌下络脉造模后1天0.46±0.63 0.66±0.72造模后15天0.46±0.63 1.46±0.63**造模后30天0.26±0.45 2.33±0.61**造模后1天0.60±0.73 1.13±0.51*造模后15天0.40±0.50 2.33±0.72**造模后30天0.80±0.67 3.13±0.83**

图3 舌下络脉演变图像

本实验采用烟熏联合气道滴注LPS 的造模方式，通过HE染色、血气分析从现代医学角度证实COPD疾病模型的成功制备。对动物模型的宏观表征定量分析提示COPD 模型大鼠首先出现了平静及游泳后呼吸频率加快、喘息气促、动则尤甚的表征；体重减轻、增幅小的消瘦表征；毛色亮度值偏低等毛发干枯、无光泽的表征；力竭游泳时间距离缩短、活动能力不足、四肢抓力下降的神疲乏力、懒动、肌力下降等表征。随着观察时间延长，大鼠上述表征并未得到明显好转，且舌质、舌色及舌下络脉评分出现了明显血瘀征象。从疾病模型反应证候特征的宏观表征入手是四诊信息的连续全面收集的关键，也是对证候中相关症状体征客观评价的核心。

基于对大鼠生物表征的连续动态观测，本研究认为LPS联合烟熏长期作用于肺脏，肺失宣降而发本病，肺在体合毛而见毛发干枯；子盗母气，脾失健运而消瘦；久病脏腑功能减退，故神疲乏力、少气懒动；气虚运血无力，血行迟缓脉络瘀滞，而见舌暗红脉络瘀阻。从病因学角度出发[18]作为颗粒物暴露的烟草燃烧以鼻窍、口咽为侵入途径，初期损伤人体一身之气，肺为华盖当先受其害；后期入血伏于阴分而携瘀挟滞，痹阻肺络。LPS近年来从中医病因学角度被认为是外源性污秽之血[19]，作用于动物可致血瘀。

综上所述，本实验通过以公认的造模因素及实验动物为载体、连续相关定量评价指标体系为依据，参考“生物表征”及“因、脉、证、治”的理论为基础的研究思路建立证候模型。烟熏联合LPS 制备COPD 稳定期疾病大鼠模型既与西医病理改变相一致，又具备中医病因特征，其证候演变早期以气虚为重，晚期由虚致瘀出现了气虚血瘀的证候表征。本次实验以西医病因病理造模方法为出发点，具有良好的稳定性及重复性，使实验结果趋于稳定且具有可比性，同时克服了造模方法缺乏中医病因学支持的缺陷，并对动物宏观表征的定量化分析，使病证结合模型更加具有逻辑性、客观性和科学性[20]，对COPD 稳定期益气活血方药的机制研究、证候本质的挖掘工作具有一定的科研应用价值。