miR-30d-5p对转化生长因子-β1诱导肾小管上皮细胞生长及迁移的影响

陈香文，廖湘平，李淑梅，李建平，刘志超，肖 华，吴 琼，龙圣海，龙英杰，谢先达，唐代荣，张 浩

0 引 言

肾间质纤维化又称肾小管间质纤维化，是各种病因引起的进行性肾损害的主要病理特征[1]。肾间质纤维化是导致终末期肾病的基本病理改变之一[2]，存在于大多数进展性肾疾病和慢性肾疾病中，提示患者预后不良[3]。miRNA是真核生物中发现的一类内源性非编码RNA，长度为20～25个核苷酸。成熟的miRNA通过互补碱基配对识别目标mRNA，降解靶mRNA或抑制其翻译。在功能上，miRNA广泛参与各种生物过程[4]。在肿瘤疾病中，miRNA在影响肿瘤发生、进展和转移方面起着至关重要的作用[5]。同时，miRNA在肾发育和肾疾病中也具有重要意义[6]。研究表明，miR-30d在转化生长因子-β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)诱导的大鼠肾小管上皮细胞中表达上调，影响肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化过程[7]。然而miR-30d-5p是否影响TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞生长及迁移尚不清楚。骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7, BMP7)在TGF-β1处理的大鼠肾小管上皮细胞中表达下调[8]。因此，本研究拟利用TGF-β1刺激肾小管上皮细胞HK-2，探讨miR-30d-5p在细胞生长与迁移中的作用与机制，为肾间质纤维化提供潜在的治疗靶标。

2 材料与方法

1.1 细胞与试剂肾小管上皮细胞HK-2购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，DMEM/F12(1∶1)培养基购自美国Gibco公司，miR-30d-5p、miR-NC、anti-miR-30d-5p、anti-miR-NC、pcDNA3.1-BMP7、pcDNA3.1、si-BMP7、si-NC均购自广州锐博生物公司，抗P21(BS6561)、抗E-钙黏蛋白(E-cadherin)(BS1098)抗体均来自美国Bioworld Technology公司，抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)(ab8245)、山羊抗兔IgG抗体(ab6721)购自美国Abcam公司，增强的化学发光检测试剂购自上海Beyotime生物技术研究所。

1.2细胞培养HK-2细胞在DMEM/F12培养基中培养[9]，其中包含10%胎牛血清。2～3 d换液1次，按1∶4的比例传代。

1.3细胞转染与分组HK-2细胞接种于96孔板中，生长至60%汇合时，使用Lipofectamine 2000试剂，将miR-30d-5p、miR-NC、anti-miR-30d-5p、anti-miR-NC、pcDNA3.1-BMP7、pcDNA3.1、si-BMP7、si-NC转染HK-2细胞。HK-2细胞分为：空白组(未经任何处理)、TGF-β1组、miR-NC组(转染miR-30d-5p阴性对照miR-NC)、miR-30d-5p组(转染miR-30d-5p)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-30d-5p阴性对照anti-miR-NC)、anti-miR-30d-5p组(转染anti-miR-30d-5p)、miR-30d-5p+pcDNA3.1组(转染miR-30d-5p与pcDNA3.1-BMP7阴性对照pcDNA3.1)、miR-30d-5p+pcDNA3.1-BMP7组(转染miR-30d-5p与pcDNA3.1-BMP7)、anti-miR-30d-5p+si-NC组(转染anti-miR-30d-5p与si-BMP7阴性对照si-NC)、anti-miR-30d-5p+si-BMP7组(转染anti-miR-30d-5p与si-BMP7)。除con组外，其他各组经TGF-β1处理。其中，TGF-β1处理时采用10 ng/mL TGF-β1作用于HK-2细胞24 h[8]。

1.4双荧光素酶报告实验starBase网站(http://starbase.sysu.edu.cn/)在线预测显示，BMP7可能是miR-30d-5p的潜在靶标，进行荧光素酶活性测定以确定miR-30d-5p是否靶向BMP7的3'非编码区(3'untranslated region, 3'UTR)。使用含有miR-30d-5p结合位点的BMP7 3'UTR构建野生型(WT-BMP7)和突变型(MUT-BMP7)荧光素酶报告载体。在转染前，将HK-2细胞接种在6孔板中过夜。第2天，使用Lipofectamine 2000将miR-NC、miR-30d-5p与WT-BMP7、MUT-BMP7萤光素酶报告基因共转染到HK-2细胞中。孵育24 h，收集细胞，使用双荧光素酶报告基因检测系统测定萤火虫和海肾萤光素酶的活性。

1.5qPCR检测miR-30d-5p和BMP7 mRNA的表达使用TRIzol试剂从HK-2细胞中提取总RNA，以分析miRNA和mRNA的水平。将RNA逆转录为cDNA，根据以下引物序列进行扩增，使用2-ΔΔCt法分析miR-30d-5p和BMP7 mRNA表达。基因及序列为：miR-30d-5p上游:5′-UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG-3′，下游:5′-TGTAAACATCCCCGACTGGAAGA-3′，U6上游:5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′;BMP7上游:5′-CGCCATCGTCCAGACACTGG-3′，下游:5′-GCTAGTGGCAGCCACAGGCC-3′，GAPDH上游:5′-CAAGATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′，下游:5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGTT-3′

1.6Western blot检测P21、E-cadherin、BMP7蛋白表达使用冷放射免疫沉淀测定裂解缓冲液裂解HK-2细胞，采用双辛可宁酸蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离30 μg蛋白，转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h后，用一抗孵育膜：抗P21(1∶1000)、抗E-cadherin(1∶1000)、抗BMP7(1∶1000)和抗GAPDH(1∶1000)抗体在4 ℃过夜，将膜与山羊抗兔IgG H&L抗体(1∶5000)在室温下孵育2 h，使用增强的化学发光检测试剂可视化结果，通过ImageJ软件对结果定量。

1.7MTT检测细胞活性HK-2细胞接种于96孔板中，每孔5×103个细胞。48 h后将20 μL MTT溶液添加到每孔中，孵育4 h，加入150 μL二甲亚砜，通过酶标仪测定波长490 nm处的吸光度(A)值。以生长率表示细胞的活性，其值越大，提示细胞活性越强。

1.8Transwell小室法检测细胞迁移HK-2细胞悬浮于无血清的DMEM/F12培养基中，吸取5×104个细胞接种于Transwell上室，下室添加600 μL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。24 h后，使用4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色20 min，光学显微镜下统计迁移细胞数。

2 结 果

2.1 TGF-β1对肾小管上皮细胞的P21、E-cadherin蛋白及miR-30d-5p的表达的影响与空白组比较，TGF-β1组肾小管上皮细胞的miR-30d-5p表达、生长率和迁移细胞数明显升高(P<0.05)，P21和E-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)，见图1，表1。

图1 TGF-β1对肾小管上皮细胞中P21、E-cadherin蛋白表达的影响Figure 1 Effect of TGF-β1 on the expression of P21 and E-cadherin in renal tubular epithelial cells

表1 抑制miR-30d-5p对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞的细胞活性及迁移的影响Table 1 Effects of miR-30d-5p inhibition on cell viability and migration of renal tubular epithelial cells induced by TGF-β1

2.2过表达miR-30d-5p对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞的细胞活性及迁移的影响与miR-NC组比较， miR-30d-5p组肾小管上皮细胞miR-30d-5p表达、生长率和迁移细胞数明显增加(P<0.05)，P21和E-cadherin蛋白表达显著减少(P<0.05)，见图2，表1。

图2 过表达miR-30d-5p对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞中P21、E-cadherin蛋白表达的影响Figure 2 Effect ofoverexpression of miR-30d-5p on the expression of P21 and E-cadherin in renal tubular epithelial cells induced by TGF-β1

2.3抑制miR-30d-5p对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞的细胞活性及迁移的影响与anti-miR-NC组比较， anti-miR-30d-5p组肾小管上皮细胞的miR-30d-5p表达、生长率和迁移细胞数明显降低(P<0.05)，P21和E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05)，见图3，表1。

图3 抑制miR-30d-5p对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞中P21、E-cadherin蛋白表达的影响Figure 3 Inhibition of miR-30d-5p on the expression of P21 and E-cadherin in renal tubular epithelial cells induced by TGF-β1

2.4miR-30d-5p靶向BMP7表达starBase网站预测出miR-30d-5p可靶向结合于BMP7 3′UTR。双荧光素酶报告实验结果显示，与 miR-NC组比较，miR-30d-5p组WT-BMP7荧光素酶的活性明显降低 (P<0.05)，对MUT-BMP7荧光素酶的活性无显著影响(P>0.05)。qPCR检测显示，与miR-NC组比较，miR-30d-5p组的BMP7 mRNA表达明显降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-30d-5p组的BMP7 mRNA表达显著升高(P<0.05)，见图4。

与miR-NC组比较，*P<0.05；与 anti-miR-NC组比较，#P<0.05图4 双荧光素酶报告实验及miR-30d-5p调控BMP7的表达Figure 4 Doubleluciferase reporter assay and expression of BMP-7 regulated by miR-30d-5p

2.5过表达BMP7逆转miR-30d-5p对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞的细胞活性及迁移的影响与miR-30d-5p+pcDNA3.1组比较， miR-30d-5p+pcDNA3.1-BMP7组肾小管上皮细胞的BMP7、P21和E-cadherin蛋白表达明显增加(P<0.05)，生长率和迁移细胞数显著减少(P<0.05)。见图5，表2。

图5 过表达BMP7逆转miR-30d-5p对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞中P21、E-cadherin蛋白表达的影响Figure 5 Overexpression of BMP7 can reverse the effect of miR-30d-5p on the expression of P21 and E-cadherin in renal tubular epithelial cells induced by TGF-β1

2.6抑制BMP7能逆转抑制miR-30d-5p对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞的细胞活性及迁移的影响与anti-miR-30d-5p+si-NC组比较， anti-miR-30d-5p+si-BMP7组肾小管上皮细胞的BMP7、P21和E-cadherin蛋白水平明显降低(P<0.05)，生长率和迁移细胞数显著升高(P<0.05)。见图6，表2。

图6 抑制BMP7逆转miR-30d-5p对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞中P21、E-cadherin蛋白表达的影响Figure 6 Inhibition of BMP7 can reverse the effect of miR-30d-5p on the expression of P21 and E-cadherin in renal tubular epithelial cells induced by TGF-β1

表2 抑制BMP7能逆转抑制miR-30d-5p对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞的细胞活性及迁移的影响Table 2 Inhibition of BMP7 can reverse the effect of miR-30d-5p on TGF-β1-induced cell viability and migration of renal tubular epithelial

3 讨 论

肾间质纤维化是慢性肾疾病的常见病理特征，其发展和进程受表观遗传修饰的影响，包括miRNA异常的表达。TGF-β1可被所有类型的肾细胞和浸润的炎性细胞分泌，是肾细胞中的纤维化剂[10]。资料显示，TGF-β1通过调节某些miRNA的水平介导其作用，这些miRNA已经成为重要的调节分子[11]。本研究中，TGF-β1被用作体外肾小管上皮细胞HK-2的诱导剂，旨在研究miR-30d-5p潜在的功能与机制；10 ng/mL的TGF-β1刺激HK-2细胞24 h后，导致生长率和迁移细胞数增加，增殖相关蛋白P21和迁移相关蛋白E-cadherin蛋白水平降低，表明TGF-β1可以诱导肾小管上皮细胞增殖和迁移，有助于肾间质纤维化进展，与前人研究[8-9]一致。

miRNA已被证明可调节多种癌症的进展，并已成为控制肾间质纤维化的可能治疗剂[12-14]，miRNA通过调控肾脏功能蛋白的表达，影响肾纤维化和功能障碍。既往研究揭示了miR-30d-5p在人类恶性肿瘤的发生发展起不同的关键作用，如miR-30d-5p在卵巢癌[15]、非小细胞肺癌[16]和结肠癌[17]中表达下调，作为抑癌基因；而在胆管癌[18]中表达上调，是胆管癌潜在的生物标志物。Bukauskas等[19]证明在急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭和肾功能正常人的血清miR-30d-5p的表达水平没有显著差异，表明miR-30d-5p与急、慢性肾功能衰竭的发生没有直接关系。然而，迄今为止，关于miR-30d-5p在肾疾病中的生物学功能和意义方面的资料仍然有限。本研究中，采用TGF-β1刺激HK-2细胞，细胞中miR-30d-5p的上调，这与之前的研究结果[7]相同。另外，过表达miR-30d-5p明显增加TGF-β1诱导HK-2细胞的生长率和迁移细胞数，显著减少P21和E-cadherin蛋白表达，而抑制miR-30d-5p发挥着相反的作用，说明过表达miR-30d-5p可促进TGF-β1诱导的HK-2细胞生长及迁移，促进肾间质纤维化的发生发展，相反，抑制miR-30d-5p则阻止此进程，这些结果为miR-30d-5p在肾病变过程提供了新颖的见解。

越来越多的证据表明，BMP7在肾疾病中具有重要作用，例如，BMP7通过下调miR-21抑制糖尿病肾病的肾纤维化[20]。TGF-β1和BMP7在肾小管上皮细胞的上皮间充质转化过程中起着相互矛盾的作用，在诱导小鼠单侧输尿管梗阻之后，肾中BMP7的表达水平升高，BMP7对损伤的肾小管上皮细胞表现出保护作用[21]。BMP-7可以减弱TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞凋亡和纤连蛋白分泌[22]，还能减少顺铂诱导的肾脏损伤和肾小管上皮细胞凋亡[23]，这些资料表明BMP7对肾损伤具有一定的保护作用。本研究中，生物信息预测和双荧光素酶证实了miR-30d-5p对BMP7的靶向调控，过表达BMP7可逆转miR-30d-5p对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞HK-2的细胞活性及迁移的促进作用，并逆转其对P21和E-cadherin蛋白表达的抑制作用；而抑制miR-30d-5p对TGF-β1诱导HK-2细胞的细胞活性及迁移的抑制作用，对P21和E-cadherin蛋白表达的促进作用则均可被抑制BMP7所逆转。这些数据证实，BMP7是miR-30d-5p的功能性靶基因，靶向调控BMP7的表达可能是miR-30d-5p影响TGF-β1诱导肾小管上皮细胞活性和迁移的重要途径之一。

总之，miR-30d-5p在TGF-β1诱导肾小管上皮细胞HK-2中表达上调，过表达miR-30d-5p可以促进TGF-β1诱导的HK-2细胞增殖和迁移，抑制miR-30d-5p时具有相反的作用，其作用机制与靶向调控BMP7的表达有关，这将为预防肾间质纤维化提供更多途径。