2018 年广西活禽市场鸡新城疫病毒病原学监测

曾婷婷 谢芝勋 谢丽基 谢志勤 张艳芳 黄娇玲张民秀 范 晴 罗思思 王 盛

广西壮族自治区兽医研究所，南宁530001

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）强毒株感染引起的一种烈性传染病，是世界动物卫生组织（OIE）规定的必须通报的疫病之一。NDV 宿主范围广泛，目前发现超过250 种禽类可以感染NDV。在世界范围内已发生过4 次大规模的新城疫暴发，每次都伴随着新的基因型和新的感染宿主出现。因此，对NDV流行毒株进行病原学监测和分子流行病学信息跟踪是防控NDV 的重要内容。为了解NDV 在活禽市场的鸡群中的感染情况，2018 年本实验室从广西境内10 个活禽市场采集鸡咽喉和泄殖腔拭子共705份，进行病毒分离鉴定，并扩增和分析13 份HI 试验阳性样品的NDVF基因，旨在为鸡NDV 的流行病学提供研究材料和依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

1.2 方 法

病毒分离方法和基因扩增、克隆、测序参考谢丽基等[1]。设计4 对引物扩增NDVF基因，FGENE 1 和FGENE 2 扩增产物拼接可得到NDV CLASS ⅠF基因全长，FGENE 3 和FGENE 4 扩增产物拼接可得到NDV CLASS ⅡF基因全长（引物见表1）。

1.3 F 基因遗传进化分析

根据测序结果，推导出NDV分离株F基因的氨基酸序列，确定aa112～aa117 裂解位点基序。参照Gen-Bank 中相关序列，利用MEGA 6 软件对F基因序列进行系统进化分析，采用neighbor joining test（Maximum Composite Likelihood 模型）构建系统遗传进化树[2]。

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 病毒分离结果

经过SPF 鸡胚病毒分离和NDV 标准血清HI试验，结果共有13 份尿囊液为NDV HI 试验阳性。

2.2 F 基因扩增和比对分析

13 份NDVF基因扩增和测序后，blast 比对发现，分离株全部为CLASS Ⅰ基因1 b 亚型NDV。根据FO 蛋白裂解位点112-117 位氨基酸序列推测该毒株的致病性[3]，所有分离获得的CLASS Ⅰ基因1 b亚型NDV 均为弱毒株。

2.3 F 基因的遗传进化分析

图1 NDV F 基因系统进化树

根据Diel 等[2]提出的新的NDV 基因分型方法，采用F基因全长，构建进化树。结果显示，与blast 结果相符，获取的13 个NDVF基因序列均归属于CLASS Ⅰ基因1 b 亚型分支（图1）。

3 讨 论

NDV 只有1 个血清型，但根据病毒F基因高变区序列差异可将毒株分为两类：Ⅰ类（CLASS Ⅰ）和Ⅱ类（CLASS Ⅱ）。目前全世界范围内暴发的ND 流行毒株和常用疫苗株均属于CLASS Ⅱ，至少包含Ⅰ-XVIII 18 个基因型。CLASS ⅠNDV 在2003 年首次从法国野生麻鸭中分离得到[4]，随后也在中国被陆续报道[5]。CLASS ⅠNDV 绝大多数为无毒株或弱毒株，目前仅分离到2 个CLASS Ⅰ强毒株[6-7]，但CLASS ⅠNDV 可在鸡或鸡胚中传代增强毒力[8]。因此，在进行NDV 病原学监测时，对CLASS ⅠNDV 的监测也是重要内容。

本研究中，从705 份鸡的咽喉/泄殖腔棉拭子中分离到13 个NDV 毒株，分离率为1.84%，与本实验室2017 年的监测结果相似[1]。分析这些毒株的F基因序列发现，13 个NDV 毒株均为CLASS ⅠNDV。CLASS ⅠNDV 在发现前期主要分布于水鸟、海鸟和水禽[9]，本研究结果表明，CLASS ⅠNDV已经由水禽向陆生禽类传播，这与王静静等[10]的研究结果相似。

根据Diel 提出的新的NDV 基因分型方法，CLASS ⅠNDV 只有1 个基因型，含1 a、1 b、1 c 3 个基因亚型[4]。使用这13 个NDV 分离株的F基因核苷酸序列与参考毒株绘制系统进化树，全部属于CLASS Ⅰ1 b NDV。但这13 个毒株与CLASS Ⅰ1 b NDV 参考株分别位于2 个小分支，具有地域特征。说明NDV 在流行传播的过程中，在不同地区也形成了自己的分子特征。后续还将对这些毒株进行致病性试验和全基因序列测定，为Ⅰ类NDV 的流行传播规律、病原学和分子特征提供更多数据。