江苏－山东沿岸大型绿藻微观繁殖体时空分布特征研究

缪晓翔，肖洁,2,3，王宗灵,2,3*，李艳,2,3，刘萍,2,3，姜美洁，张学雷,2,3

( 1. 自然资源部第一海洋研究所，山东 青岛 266061；2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋生态与环境科学功能实验室，山东 青岛 266237；3. 自然资源部海洋生态环境科学与技术重点实验室，山东 青岛 266061)

1 引言

绿潮是大型海洋绿藻脱离固着基后大量增殖引起的一种异常生态现象，主要发生在河口、内湾、潮间带和城市密集的海岸，世界许多沿海国家均有记录[1–4]。自2007 年以来，我国南黄海海域连续暴发以浒苔为优势种的绿潮灾害，引起政府部门和科研单位的高度重视[5–7]。2008 年，青岛沿海高密度聚集的浒苔绿潮分布面积高达33 000 km2，严重威胁了北京奥运会青岛奥帆赛的顺利进行；其后，每年春、夏季，高生物量漂浮浒苔聚集于南黄海西部、从苏北浅滩至山东半岛南岸海域，给江苏、山东沿海城市的生态环境和旅游经济带来重大负面影响[6,8]。近10 年来，我国学者对于浒苔绿潮的成因、暴发过程、动力学机制、环境要素、原因种浒苔的生物学、生态学特征等方面，展开了大量的研究[6–7,9–12]。研究发现南黄海苏北浅滩是黄海浒苔绿潮的重要起源地，在每年4 月中旬回收紫菜养殖筏架时，大量的附生绿藻被机械清理弃置浅滩，由于浒苔具有很强的漂浮能力，随潮水运动即形成漂浮绿藻，成为绿潮漂浮生物量的早期来源；海区丰富的营养盐促使漂浮绿藻生物量迅速上升，最终在风和海流驱动下向北漂移形成大规模绿潮[13–14]。这一绿潮的发生发展过程已被大量的现场调查、遥感监测和模拟研究所证实，但目前对于绿藻微观繁殖体在绿潮暴发过程中的作用知之甚少，尤其是在绿潮前期孕育过程中的作用以及对大面积漂浮生物量的贡献等，尚缺乏定性和定量的研究。

绿藻微观繁殖体是放散的孢子、配子、合子、不同生长阶段的显微个体及有生长能力的绿藻碎片的统称[15–16]，其在一些机会主义绿藻暴发形成藻华的过程中起着重要的作用。Lotze 等[17]发现绿藻微观繁殖体对于低温、高盐、黑暗等不利环境条件具有较强的抗逆能力，一年生海藻能在近岸海域形成“繁殖体库”度过寒冬，并为来年春季生物量短时间内暴发性增殖、形成藻华提供“种子”。不同于世界上其他海域的绿潮，黄海浒苔绿潮分布范围广，从南黄海苏北浅滩（32°N）到山东半岛南岸（36.5°N），从江苏、山东沿岸（119.5ºE）至黄海中部（123ºE）均有漂浮生物量聚集，漂浮生物量存在远距离迁移过程[12,18–19]。前期调查发现微观繁殖体的分布和数量与叶状体（包括定生与漂浮绿藻）有着密切关系，并存在明显的时空变化。非绿潮暴发期，绿藻微观繁殖体在苏北浅滩区及邻近的近岸海域广泛分布，种类丰富，其丰度从筏架近岸区向远岸及北部海域逐渐降低[20–22]。绿潮暴发期间，微观繁殖体随着漂浮绿藻迅速向北部和远岸海域扩展，以浒苔为主，其数量与漂浮生物量存在一定关系[21,23–25]。由此可见，绿藻微观繁殖体在近岸和远岸不同海域，无论在种类组成、分布和丰度的动态变化等方面，均存在显著差异，但其在大规模绿潮连年暴发中的作用、对漂浮生物量的具体贡献等还有待深入研究。

本研究着眼于近岸海域，在山东－江苏沿岸设置4 个固定站位，开展周年调查研究，分析近岸水体中绿藻微观繁殖体的群落结构、丰度等，研究绿潮对近岸水体绿藻微观繁殖体群落结构的影响，以期为探讨近岸海域绿藻微观繁殖体在绿潮暴发中的作用提供数据支撑。

2 材料与方法

2.1 样品的采集

在江苏、山东沿岸设置4 个定点站位（图1），分别为南通苏北浅滩调查区（3 2°2 0′～3 3°2 0′N,121°00′～121°30′E）的竹根沙（ZGS, 32°58′08″N,121°09′20″E）、连云港燕尾港沿岸（YWG, 34°32′18″N,119°41′28″E）、日照岚山港沿岸（LSG, 35°12′26″N,119°25′01″E），青岛海滨第一海水浴场（YY, 36°03′24″N,120°20′15″E）。于2016 年3 月至2017 年3 月，按月进行取样，每个站位取表层海水4 L，通过孔径200 μm筛绢过滤掉海水中的藻丝体和大型浮游生物，低温避光保存带回实验室培养。表层海水的温度、盐度参数由多参数水质仪（YSI, USA）现场读取。

2.2 绿藻微观繁殖体培养和计数

分别取1 L 海水加入到灭菌烧杯中，每升海水加入20 mL PES 培养液（Provasoli´s Enriched Seawater Medium）[26]和1 mL 二氧化锗（GeO2）（终浓度0.5 mg/mL）以抑制硅藻的生长，然后转入温度为16ºC、光辐射为80～100 μmol/(m2·s)、光周期为12 L/12 D 的智能人工气候室（202728-380，宁波江南）中培养。每个站位设3 个平行实验组，每5 d 更换一次PES 培养液保证微观繁殖体生长的养分充足。

在培养的过程中，微观繁殖体不断附着到烧杯底部和烧杯壁，20 d 左右绿藻幼苗长到约为1～3 cm。借助放大镜数出烧杯中附着萌发绿藻幼苗的数量，以确定培养海水中绿藻微观繁殖体的数量。取样站位微观繁殖体的丰度（A，株/L）计算公式：A=N/V（N 为萌发幼苗的总数，V 为培养水样的体积）。

图 1 江苏−山东沿岸4 个取样站位Fig. 1 Four sampling locations along the coasts of Jiangsu and Shandong Provinces

计数后，用消毒镊子随机取出绿藻幼苗，逐一鉴定种类。幼苗数量少于30 株的实验组，对所有幼苗进行鉴定；大于30 株的实验组，随机挑选30～80 株进行鉴定，占幼苗总数的10%～80%（平均为30%）。取出的绿藻幼苗用双蒸水漂洗2～3 次，滤纸吸干表面水分，转移至1.5 mL 灭菌离心管中冷冻保存，用于DNA 制备。

2.3 藻体幼苗种类和基因型的分子鉴定

全基因组DNA 的提取参照Hwangbo 等[27]的快速提取法并加以改进。具体步骤如下：含有单株藻体的1.5 mL 离心管中，加入100～150 μL 5% chelex 100(BioeRad, USA)螯合剂，手持式匀浆器涡旋匀浆10 s，95ºC 或沸水水浴5 min，13 000 r/min 离心1 min 去除组织碎片，将上清液移至新管，即为PCR 扩增所需的模板。绿藻种类鉴定参照Xiao 等[28]，即根据ITS 序列的PCR-RFLP 分型区分浒苔（Ulva prolifera）/缘管浒苔（U. linza）与其他常见种（扁浒苔U. compressa、孔石莼U. pertusa、未命名种Ulva sp. 以及盘苔Blidingia sp)，再以5S spacer 片段的长度多态性区分浒苔与缘管浒苔。扩增ITS 片段（包括 ITS1，5.8S 以及ITS2）SCAR 和5S 的引物见表1。ITS 扩增产物经限制性内切酶BspT107 I 和EcoO109 I（大连宝生物公司）酶切、用溴化乙锭染色的2% 琼脂糖凝胶电泳分离后，在c150 成像系统（Azure Biosystem, USA）上显色观察。

为进一步追踪“漂浮生态型”浒苔微观繁殖体，采用特异性的SCAR 标记[32]对已经鉴定为浒苔的样品进一步PCR 扩增，引物见表表1，随机挑选SCARPCR 产物，E.Z.N.A.TM（Omega Bio-Tek, USA）割胶回收并纯化，纯化产物进行双向测序（生工生物工程股份有限公司）。部分测序困难的样品连接至pMDTM19-T（Takara，中国上海）载体，并转化至感受态大肠杆菌DA5α，采用麦康凯选择性培养基筛选阳性克隆，经PCR 检测后，送往生工生物工程股份有限公司进行测序。所得序列与已发表数据进行比对[32]，以确定扩增片段的准确性。

2.4 统计分析

应用SPSS 16.0（SPSS Inc.）软件对培养获得绿藻微观繁殖体的丰度差异进行检验，首先采用线性插值法补充缺失数据，不同季节和站位的差异性比较通过双因素方差分析（two-way ANOVA）得到，两个站位之间的差异性比较通过独立t-检验（independent t-test）得到。通过Shapiro-Wilks 方法对数据进行正态性检验，Levene 法对数据进行方差齐性检验。

3 结果

3.1 绿藻微观繁殖体丰度与时空分布

江苏－山东沿岸4 个站位，水体中微观繁殖体的数量呈现明显的时空分布特征。整体而言，ZGS 和YY 微观繁殖体丰度高于YWG 和LSG，LSG 丰度最低（two-way ANOVA，F=8，P＜0.05），4 个站位年平均丰度分别为77 株/L、79 株/L、49 株/L、6 株/L。春季（2016 年3 月－5 月），ZGS 微观繁殖体数量（平均152 株/L）明显高于YY（平均86 株/L）（independent ttest，P＜0.05，图2），6 月和10 月，ZGS 数量（平均29 株/L）显著下降，且远低于YY（平均132 株/L）（independent t-test，P＜0.05）；其他月份（11 月至翌年2 月），ZGS 微观繁殖体数量（平均55 株/L）与YY（平均39 株/L）无明显区别（independent t-test，P＞0.05）。

各站位水体绿藻微观繁殖体丰度呈现明显的季节性波动。ZGS 站最低值为19 株/L，最高值为249 株/L，其数量在春季（3−4 月份）快速增长，5 月达到峰值249 株/L（SE=48 株/L，SE 为标准误差），随后快速下降，深秋（11 月份）达到次高峰120 株/L（SE=12 株/L），冬季（12 月至翌年2 月）数量较低，为27～40 株/L。

YWG 和LSG2 个站位变化趋势大体一致，7 月份为峰值，平均微观繁殖体数量最高，随后微观繁殖体数量处于下降趋势，8 月份为低点，11 月份LSG 微观繁殖体数量达到另一个次高峰，冬季（1 月份）平均微观繁殖体数量最低。YWG 水体中微观繁殖体数量（0～15 株/L，平均6 株/L）远低于LSG（4～150 株/L，平均49 株/L），约为LSG 的12.2%。

表 1 引物序列及参考文献Table 1 Sequences and references of the primers used in the study

YY 站位微观繁殖体数量峰值出现在6 月，达到184 株/L（SE=36 株/L），随后微观繁殖体数量一直处于下降趋势，到9 月份进入低点，为29 株/L（SE=6 株/L），秋季（11 月）微观繁殖体数量又达到一个次高峰，为110 株/L（SE=40 株/L），冬季（1 月份）平均微观繁殖体数量最低，仅18 株/L（SE=6 株/L）。

3.2 微观繁殖体种类组成与演替

ZGS 和YY 两个站位一共检测绿藻幼苗510 株，种类包括缘管浒苔U. linza、浒苔U. prolifera、浒苔属未知种Ulva sp.、扁浒苔U. compressa、盘苔Blidingia sp.和孔石莼U. pertusa 6 种。缘管浒苔为优势种，全年均有出现，占比最高，两个站位年平均达56.3%（图3）。浒苔亦为常见种，平均占比20.0%，但其丰度呈现明显的季节性波动。ZGS 站，5－6 月和10 月，浒苔丰度较高，占比为40.0%～66.7%，其余月份比例较低，占比为7.7%～37.5%，在冬季亦能维持一定数量。YY 站波动更为显著，7 月份浒苔微观繁殖体丰度陡然增高，7−9 月份比例高达20.0%～78.6%，其余月份零星出现，占比0%～17.1%。Ulva sp.微观繁殖体数量平均为11.6%，孔石莼、扁浒苔和盘苔这3 种绿藻微观繁殖体数量明显较少，平均所占比例分别为8.0%、3.1%和1.0%。

3.3 浒苔微观繁殖体组成变化

对于鉴定出的102 株浒苔，用特异性SCAR 分子标记进一步区分其基因型。随机挑选10 个“漂浮生态型”浒苔阳性样本进行测序检验，测序结果与文献[32]中的序列相似度达100%，说明本研究中检测出的“漂浮生态型”浒苔微观繁殖体与绿潮漂浮浒苔基因型一致。统计其数量与比例发现，在ZGS 站，浒苔全年存在，5 月为最高峰，达105 株/L，2 月为最低峰；“漂浮生态型”浒苔占据绝对优势，比例高达50.0%～100.0%，全年平均占比81.7%（图4）。YY 站，浒苔微观繁殖体在7 月份陡然增高，达132 株/L，然后迅速下降，持续到9 月份（19 株/L），在其他月份零星存在；与ZGS 站不同的是，“漂浮生态型”浒苔只存在于7、8 月份，占浒苔微观繁殖体数量的37.5%～90.9%，其他月份未检测出。

4 讨论

本研究对江苏－山东沿岸水体中大型绿藻微观繁殖体进行周年监测，通过室内培养和分子检测相结合的手段，研究微观繁殖体的丰度和种群结构演替。研究发现江苏ZGS 和青岛YY 近岸水体中绿藻微观繁殖体丰度较高，而连云港YWG 和日照LSG 站丰度较低；各站位微观繁殖体群落结构均具有较高的物种多样性，并存在明显的季节性波动；“漂浮生态型”浒苔在ZGS 周年存在，并保持较高的比例。

图 2 2016 年3 月至2017 年3 月江苏−山东沿岸各站位绿藻微观繁殖体数量变化（平均值±标准误差，*代表未采样）Fig. 2 Micro-propagule abundance at four sampling locations along the coasts of Jiangsu and Shandong provinces from March 20016 to March 2017 (mean±SE, * indicates no samples collected)

江苏、山东近岸水体中绿藻微观繁殖体物种多样性水平较高，浒苔属和盘苔属常见种类均有检测出，包括6 种：缘管浒苔U. linza、浒苔U. prolifera、扁浒苔U. compressa、孔石莼U. pertusa、Ulva sp.和盘苔Blidingia sp.[28,33–35]。缘管浒苔作为优势种全年广泛分布于各站位，这与缘管浒苔的孢子在恶劣的环境中具有很强的耐受能力，更容易适应弱光条件等有关[36]。另外，田晓玲等[33]和刘峰等[37]发现江苏如东近岸和浅滩海区存在尾孢藻属（Urospora）绿藻。根据Urospora spp.序列，我们亦分析了其酶切图谱并在检测过程中加以比对，本研究培养的样本中并未检测出尾孢藻，这可能与采用的培养方法与条件有关。众多研究表明，绿藻对温度、盐度、营养盐、光照等环境条件比较敏感，不同条件会导致其萌发生长等生理活动的改变[38–43]。在对黄海浒苔绿潮的长期追踪和研究中，本课题组保持一致的培养条件，以增加数据的可重复性和可比较性。本研究亦设置13 个月的采样培养，其中3 月份连续两年的实验数据（包括微观繁殖体丰度和组成）无显著差异（independent t-test，P＜0.05），证明本研究实验方法与结果的可靠性与可重复性。

ZGS 站水体中绿藻微观繁殖体丰度和种类组成研究表明，苏北浅滩区是绿潮原因种浒苔繁殖体越冬并维持种群的重要区域。早期一系列研究显示，浅滩及邻近海域水体和底泥中周年存在较高数量的绿藻微观繁殖体[21,23,25]，对培养样本的随机测序结果显示，该海域存在浒苔微观繁殖体[44–45]，推测浅滩海域广布的浒苔繁殖体构成了黄海浒苔绿潮连年爆发的“种子库”[20–21,25,37]。随后，Zhao 等[32]发现形成绿潮的漂浮浒苔群体具有高度的遗传均一性，并开发了快速区分“漂浮”浒苔生态型的SCAR 分子标记，成为追踪绿潮浒苔原始定生种群和微观繁殖体“种子库”等的重要手段[46–47]。本研究定量分析了浅滩区水体绿藻微观繁殖体丰度和种类组成，发现该海域绿藻微观繁殖体丰度较高，且浒苔微观繁殖体周年存在；并进一步定量化浒苔和“漂浮生态型”浒苔微观繁殖体种群数量及占比，发现浅滩区浒苔微观繁殖体中“漂浮生态型”占据极大优势（占比50.0%～100%）。本研究结果进一步证实了前期推测，浅滩海域是浒苔微观繁殖体的重要“栖息地”，在维持浒苔种群中起着重要作用。

图 3 2016 年3 月至2017 年3 月ZGS 和YY 站绿藻微观繁殖体种类组成（*代表未采样）Fig. 3 Species composition of the mciro-propagule communities at ZGS and YY stations from March 2016 to March 2017 (* indicates no samples collected)

与苏北浅滩ZGS 站相比，青岛YY 水体中绿藻微观繁殖体群落演替呈现截然不同的季节性变化特征。徐福祥等[48]遥感监测结果，2016 年7 月初大规模漂浮绿藻登陆青岛，8 月初逐步消失；与此对应，夏季（7－8 月）大规模绿藻到达青岛海滨时，青岛近岸水体绿藻微观繁殖体种类发生剧烈变化，优势种从缘管浒苔转变为浒苔，并且“漂浮生态型”浒苔微观繁殖体大量出现；而在其他季节未有大规模漂浮绿潮时，浒苔微观繁殖体始终处于低值，冬季未检测到“漂浮生态型”浒苔微观繁殖体，此结果与Zhao 等[35]2014－2015 年检测结果完全一致。这些研究表明青岛本地微观繁殖体群落结构受到大规模漂浮浒苔的季节性扰动，其组成结构在绿潮暴发期会发生显著变化，但影响较为短暂。

上述不同海域监测结果对比发现，苏北浅滩在维持绿潮浒苔种群、引发黄海大规模绿潮连年暴发中起着重要作用。但对于浒苔种群如何在浅滩海域维持其种群、浅滩区具体哪些环境因素起重要作用等，尚未有深入的研究。前期研究显示，浅滩海域大量筏架设施[49]、充足的营养盐供给[50]、春季快速升高的水温和光照条件等[44]，对浒苔微观繁殖体附着萌发形成新的生物量提供了有利条件。然而，绿潮浒苔维持其种群数量的内在因素与外在条件等，还需要进一步研究。Zhao 等[35]从青岛沿海定生绿藻群体中检测到极少量（约0.3%）“漂浮生态型”浒苔样本，推测在长期漂浮浒苔大规模侵入以及绿潮期间大量浒苔微观繁殖体释放等压力下，“漂浮生态型”浒苔存在一定的北侵风险。该研究强调了进一步长期监测江苏－山东近岸海域环境中绿藻微观繁殖体的必要性，受全球气候变化和人类活动的影响，黄海近岸海域生态环境正逐步改变，如：海水表层温度上升[51]，条斑紫菜养殖迁移（南菜北养）[52]，加上养殖业和工业的快速发展，营养盐水平普遍升高[53–54]等，是否对浒苔微观繁殖体种群维持与变化产生了影响，值得深入研究。

图 4 2016 年3 月至2017 年3 月ZGS、YY 站浒苔微观繁殖体丰度及“漂浮生态型”浒苔占比（*代表未采样）Fig. 4 Abundance of the total and ‘floating’ type of U. prolifera at ZGS and YY stations from March 2016 to March 2017 (* indicates no sample collected)