湖南48个水稻栽培品种抗瘟性评价及抗性基因鉴定

贺 雄， 丁朝辉， 胡立冬， 任佐华， 周 瑚，3， 朱华珺，3， 李俊俊， 丁宇倩， 戴良英，3， 刘二明，3

(1.湖南农业大学植物保护学院/植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，湖南长沙 410128；2.湖南省桃江县农业局，湖南益阳 413400；3.南方粮油作物协同创新中心，湖南长沙 410128)

水稻稻瘟病是由稻梨孢丝状真菌(有性态为Magnaportheoryzae，无性态为Pyriculariaoryzae)侵染引起，是一种水稻灾害性病害[1]。选育和推广高效的抗病品种，是防治稻瘟病最经济、最有效、最安全的方法[2]。选育和推广抗病品种，不仅对稻瘟病有优良的防治效果，而且能减少化学农药的使用，降低生产成本，减少坏境污染；但是，同一个抗病品种大面积种植所形成的选择压极易导致稻瘟病菌发生变异，产生新的生理小种，从而使推广的水稻抗病品种在3～5年就可能丧失抗病性[2-3]。因此，不断监测稻瘟病菌的变异程度与水稻抗性品种的抗病性，及时筛选新的抗性品种对稻瘟病的防治十分重要[4]。

稻瘟病菌与水稻品种之间的特异性互作符合Flor的“基因对基因”假说[5]。本研究利用10株具有代表性的已知无毒基因的稻瘟病菌单孢菌株，对湖南种植的48个水稻品种进行抗瘟性评价和抗瘟基因型进行初步鉴定，以期为湖南水稻栽培品种合理布局防控稻瘟病提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

2017年于湖南省桃江县稻瘟病病圃采集多个水稻品种稻瘟病样，通过多倍变焦体视显微镜挑取单孢，分离得到49个稻瘟病单孢菌株后经无毒基因鉴定筛选出具有代表性的菌株10株(表1)。

1.2 供试水稻

供试水稻共48个品种(由湖南省益阳市桃江县植保站统一收集提供)，对照为笔者所在课题组繁殖的高感品种丽江新团黑谷(LTH)(表2)。

1.3 孢悬液制备及水稻育苗

利用马铃薯葡萄糖琼脂培养基将保藏于高粱粒中的稻瘟病菌单孢菌株活化后，再将其接种到番茄燕麦培养基上，于培养箱中28 ℃光暗交替培养(光—暗周期为12 h—12 h)，待稻瘟病菌菌丝长满整个平板后，加入1 mL无菌水，用灭菌棉棒将表面菌丝刮断，再用移液枪将洗脱的菌液转移到新的番茄燕麦培养基上，并用涂布器涂布均匀，28 ℃培养至新的番茄燕麦培养基平板上长满菌丝，再用含0.1% Tween-20 的无菌水洗脱孢子，并利用血球计数板将孢悬液的孢子浓度调节至2×105个/mL，供接种使用[6]。

表1 10株供试菌株包含的无毒基因

表2 48个供试水稻品种及对照

表2(续)

水稻育苗土壤为肥沃的稻田土，置于育苗盘(30 cm×20 cm×7 cm)备用。种子在室温下用清水浸泡24 h，沥干水分再置于恒温箱32 ℃催芽12 h至种子破胸露白，28～30 ℃催芽24 h，至芽长约 0.2 cm，播种到育苗盘；在秧苗1叶1心、3叶1心、接种前3 d各追施尿素1次，每次每盘施尿素1 g。

1.4 离体接种

当水稻苗长至5叶期，剪取叶片，进行针刺离体接种[6]。接种后的稻苗置于28 ℃、湿度为95%的环境中暗处理24 h，随后光暗交替(光—暗周期为12 h—12 h)培养，期间随时观察发病情况，4～6 d后记录发病情况。

1.5 数据统计

稻瘟病菌群体的毒力频率(virulence frequency，VF)=对测试水稻品种有毒力的菌株数/所有菌种菌株数×100%；当VF≥70%时病菌群体表现强毒力，50%≤VF<70%时为较强毒力，20%≤VF<50%时为中等毒力，VF<20%时为弱毒力[7]。

接种叶片上仅有黑褐色坏死斑或没有病斑时为抗病反应型；当病斑中央灰褐色、病斑比较大并有黄色发病圈时为感病反应型。通过数据分析软件DPS 7.05，利用0-1 Nei & Li最长聚类法进行聚类分析[8]。并根据10株菌株对已知抗性基因的24个近等基因系水稻品种的接种鉴定结果，对供试水稻品种进行抗瘟基因的推导与分析。

2 结果与分析

2.1 10株稻瘟病单孢菌株对48个水稻品种的毒力分析

利用已明确其无毒基因的10株稻瘟病单孢菌株对48个水稻品种进行苗期离体接种试验。结果表明，10株供试菌株接种于48个不同水稻品种后，各品种表现出的抗病能力存在较大差异，其对应的毒力频率在0～60%之间(表3)。在48个水稻品种中，表现出较强毒力的品种有丰两优4号(VF=60%)、粤禾丝苗(VF=50%)、隆两优534(VF=50%)，以上3个品种抗谱窄，在湖南地区种植抗稻瘟病效果较差，应避免在湖南稻瘟病多发地区种植；有34个水稻品种毒力频率为中等毒力(20%≤VF<50%)，占试验总数的70.83%，此34个水稻品种抗谱较广，抗稻瘟病效果一般，具有一定的抗病能力，但是随着时间的推移，有抗病能力衰减甚至丧失的风险，应慎重使用；属弱毒力(VF<20%)的水稻品种共有11个，占试验总数的22.92%，其中徽两优882、丰两优香1号毒力频率甚至低至0，这种现象可能是由于本试验菌株数量太少造成，此11个水稻品种抗性基因谱宽，抗病效果强，可结合水稻品种产量、气候等各方面因素进行推广种植。

表3 10株稻瘟病菌株对48个水稻品种的毒力频率

2.2 48个供试水稻品种抗瘟基因型分类

根据48个水稻品种与10株已知无毒基因的稻瘟病菌株的亲和反应类型结果，利用DPS 7.05数据软件建立0-1数据库，并通过0-1 Nei & Li最长聚类法进行聚类分析。结果表明，在相似系数0.70，即差异系数0.30水平上，可将48个水稻品种划分为31类(图1)。

统计每一类别内水稻品种表现抗性所关联的菌株，从而推导出供试水稻品种所含有的抗瘟基因谱(表4)，结果表明，本试验的48个供试品种抗病性都比较强(图2)，抗瘟基因Pi-1、Pi-a、Pi-7、Pi-3、Pi-i、Pi-11、Pi-19等普遍存在于各水稻谱系中，出现频率高；Pi-5、Pi-t、Pi-kp抗瘟基因出现频率比较低；抗性基因Pi-ta出现频率最低。

表4 48个水稻品种抗性基因类别推定

表4(续)

3 讨论与结论

实践证明控制水稻稻瘟病最经济有效的手段就是选育和利用抗病品种。近年来，我国各地区、各级种子管理和评审部门对参试水稻品系的稻瘟病抗性严格把控，使得新审定品种均能在中抗以上水平上得到改善[9]。但由于稻瘟病生理小种多、变化速度快、致病力差异大等原因，新品种在推广种植3～5年后，抗性就会逐渐丧失[10]。

本研究利用10株已知所含无毒基因的稻瘟病单孢菌株对湖南稻区栽培的48个水稻品种进行稻瘟病抗性鉴定，表现高抗水平的品种有11个，分别是徽两优882、吉优353、荣优390、T优259、益优701、两优6206、徽两优丝苗、丰两优香1号、湘两优143、N两优2号、创两优茉莉占，中等抗病品种34个，感病品种3个。农技部门在筛选主导品种时，应结合最新的鉴定结果，重点推广农艺性状较好的中、高抗稻瘟病水稻品种。

水稻中存在着一类编码NBS-LRR蛋白(nucleotide binding site-leucine-rich repeats)的主效抗稻瘟病基因， 这类抗病基因介导的抗性表现强烈，传统意义上称之为垂直抗性[11]。在育种应用上，抗性基因可操作性强、效果明显，因此开展主效抗性基因的鉴定及其应用研究较多。随着抗性基因数量的增加，供试材料的抗病性呈上升趋势。品种抗瘟能力与其抗稻瘟病基因型种类密切相关，不同的抗病基因型能针对不同的生理小种产生抗稻瘟病反应[12]。

大量与水稻稻瘟病鉴定与抗性基因型的推定研究当中，李刚等利用14个菌株鉴定江苏省49个水稻品种抗性基因，抗性基因Pi-a、Pi-k的出现频率比较高，达到将近80%[13]。宋兆强等利用抗瘟基因Pi-b、Pi-ta、Pi-54和Pi-km的功能标记检测了60个育种资源，得出Pi-b、Pi-ta在各水稻品种中出现的频率虽然比较高，但是该抗瘟基因抗性逐渐在减弱[14]。周瑚等利用16株含已知无毒基因的稻瘟病单孢菌株对湖南地区栽培的50个水稻品种进行了稻瘟病抗性鉴定，结果表明，出现频率最高的抗性基因为Pi-k和Pi-20，其次为Pi-t、Pi-ta、Pi-z和Pi-3；抗瘟基因Pi-5和Pi-19的出现频率低于20%[15]。

本研究基于2018年湖南稻区多个水稻品种分离的稻瘟病菌株鉴定主要抗瘟基因，其中Pi-5、Pi-t、Pi-kp等抗瘟基因出现频率稍低，抗瘟基因Pi-ta出现频率最低；主要体现在金两优383、T两优168、中早-39、丰两优四号、荆两优1189这些水稻品种的抗性基因缺失，导致抗瘟性差，选育时应慎重。杜太宗等在对Pi1、Pi9联合抗病性的研究中发现，抗性基因Pi1、Pi9二者共同作用，能够抵抗单个抗病基因不能抵抗的生理小种，拓宽抗谱，提高水稻抗病性[16]。未来在进行抗稻瘟病育种时，可把多个抗病基因聚合在一起，这将是获得持久、高抗稻瘟病品种的重要途径之一。