MicroRNA-1301在肝癌中的表达及临床意义

（南京医科大学附属无锡第二医院 肝胆外科，江苏 无锡 214001）

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是世界第5大常见的恶性肿瘤，中国患者约占55%[1]。手术是治疗HCC的主要方式，但术后复发率高，其5年生存率仍较低[2]。microRNA（miRNA）是一群内源性非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA的3'非编码区（3'UTR）结合，导致靶基因mRNA 降解或翻译受阻，以参与靶基因的转录后调节[3]。有研究表明，miR-1301在包括HCC 内的多种肿瘤中表达下调，对肿瘤的发生、发展起到抑制作 用[4-7]，但其与肝癌患者临床预后关系尚不明确。本研究通过检测HCC组织中miR-1301的表达水平，分析其与患者临床数据及预后的关系，可能为HCC 患者预后评估提供新的分子标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年1月—2014年1月在南京医科大学附属无锡第二医院行HCC根治手术的60例患者临床资料、组织样本及随访资料。根据miR-1301相对表达量数值的中位数截点，将患者分为高表达组和低表达组，每组30例。所有癌组织及相应癌旁组织（距肿瘤边缘＞2 cm的正常肝脏组织）均与液氮速冻并保存于-80℃冰箱。患者术后第1、3及6个月复查CT、血清甲胎蛋白（alpha-fetal protein,AFP），之后每半年复查CT及AFP，所有考虑复发转移的患者有CT、超声造影、AFP或穿刺活检病理等其中2或3项诊断，患者随访时间截至2019年1月。本研究通过医院伦理委员会批准，患者及其家属知情同意。

1.2 方法

所有肝癌组织及癌旁组织的RNA 通过Trizol（美国Invitrogen公司）提取，具体步骤参照试剂盒说明书。通过逆转录试剂盒（美国Applied Biosystems公司）将RNA 逆转录成互补DNA，然后应用miR 特异性TaqMan 探针和TaqMan Universal PCR Master Mix（美国ABI公司）进行miR-1301的实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测，反应在StepOne Plus 探测系统（美国ABI公司）上进行，反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，60℃延伸1 min，共40个循环。内参为RNU6B，每个反应设置3个复孔，miR-1301的相对表达量用2-∆∆Ct法计算。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验，影响因素的分析用多因素Cox 风险比例模型，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-1301在肝癌组织中表达降低

癌组织组与癌旁组织组miR-1301相对表达量分别为（26.900±8.994）和（41.183±10.759），经t检验，差异有统计学意义（t=7.824，P=0.000），癌组织组低于癌旁组织组。见图1。

图1 HCC 患者癌组织与癌旁组织中miR-1301相对表达量比较（±s）

2.2 miR-1301相对表达量与患者临床病理特征的关系

miR-1301相对表达量在患者性别、年龄、乙型肝炎病毒、肿瘤部位、AFP水平及Child分级比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）；而肿瘤直径、临床分期及有无脉管癌栓比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同影响因素的miR-1301的高表达率比较

续表1

2.3 miR-1301表达下调提示肝癌患者不良预后

为分析miR-1301表达与患者临床预后的关系，绘制miR-1301 低表达组和高表达组Kaplan-Meier曲线。miR-1301 低表达组总生存为23.33%（7/30），miR-1301 高表达组总生存为50.00%（15/30），经Log-rank χ2检验，结果显示miR-1301 低表达组肝癌患者总生存率低于高表达组（χ2=0.032，P=0.021）（见 图2）。单因素分析显示，肿瘤直径、脉管癌栓、临床分期及miR-1301表达量与患者不良预后有关（P＜0.05）。多因素Cox 回归模型分析显示，肿瘤直径、脉管癌栓临床分期、miR-1301 低表达是影响肝癌预后的独立因素（P＜0.05）。见表2。

图2 HCC组织中miR-1301表达与患者总生存率的关系

表2 肝癌患者术后预后影响因素的单因素及多因素分析参数

3 讨论

miRNA是一类长约23 个核苷酸序列的非编码小RNA，对几乎所有肿瘤的发生、发展过程扮演重要角色，例如HCC，其参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及转移等生物过程[8]。近年来在肿瘤预后标志物研究领域，miRNA 已成为新的研究热点，已发现多个miRNA与肝癌的临床预后相关，其具有成为肝癌预后分子标志物的潜能[9-12]。

越来越多的研究表明，miR-1301 对包括HCC 内的多种肿瘤表达下调，对肿瘤的发生、发展起到抑制作用，提示患者的不良预后。YANG 等[4]发现，miR-1301 在肝癌中表达下调，靶向调控BCL9 mRNA，通过Wnt/β-catenin 信号通路抑制肝癌的侵袭、转移及血管形成。ZHI 等[6]发现，miR-1301 通过靶向调控N-Ras 抑制人胶质瘤细胞的增殖，此外miR-1301 的表达下调还与胶质瘤患者不良预后相关[12]。YAO 等[14]研究发现，miR-1301 可通过介导RanGAP1 下调，增加慢性粒细胞白血病患者伊马替尼的疗效。本研究同样发现，miR-1301 在肝癌组织中表达下调，首次发现miR-1301 表达水平与肝癌患者的肿瘤直径、临床分期及有无脉管癌栓相关，Kaplan-Meier 生存分析结果提示，miR-1301 高表达组总生存率高于低表达组，进一步单因素及多因素分析提示，miR-1301 表达量是影响肝癌预后的独立因素，可能为肝癌的预后评估提供新的途径。

综上所述，miR-1301 在多种肿瘤中扮演抑癌基因作用，miR-1301 的表达下调促进肿瘤的发生、发展，提示患者的不良预后。一种miRNA 可调控不同的靶基因从而发挥不同的生理功能。进一步研究miR-1301 在肝癌发生、发展中的具体分子机制，可能为肝癌的诊断、治疗及预后评估提供新的分子标志物。