联合应用IL-4突变体及抗IL-25抗体对哮喘小鼠炎性细胞及细胞因子水平的影响

成家军 张方琪 张芳 杨学敏

哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，由免疫细胞及结构细胞(包括T细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、和上皮细胞)共同导致气道炎症、粘液分泌及气道重塑[1]。全球约3亿哮喘患者，每年约有250000患者死于哮喘，且需要有十亿美金的医疗支出[2]。近年来，随着环境污染，食品污染等，过敏患者越来越多，继而使哮喘发病率不断升高，部分患者控制差，临床急需针对哮喘气道炎症治疗的新方法[3]。哮喘是多种细胞参与的慢性气道炎症，嗜酸性粒细胞是哮喘气道炎症的关键效应细胞，

细胞因子IL-4、IL-5、IL-13及肿瘤坏死因子α(TNFα)，在哮喘气道炎症中发挥主要作用[4]。IL-4是B淋巴细胞合成IgE过程中的关键因子，IgE直接参与哮喘发生，在气道炎症及气道高反应中，IL-4比IL-13发挥的作用更加重要[5]。

研究表明，nuocytes等2型固有免疫细胞可不依赖于T细胞、B细胞直接诱导小鼠产生哮喘表型，其中IL-25、IL-33等细胞因子在2型固有免疫细胞功能调控中起到关键作用，且很可能成为新的变应性哮喘的防治靶点[6]。为此，我们拟在前期的研究基础上，进一步观察IL-4突变体联合抗IL-25抗体对哮喘小鼠的影响，探讨哮喘发病中适应性免疫应答和固有免疫应答之间交互控制作用，丰富变应性哮喘的治疗内容，为其防治提供新的思路。

资料与方法

一、材料

① 动物：雌性BALB/c小鼠(6～8周龄)，来源于空军军医大学实验动物中心，非含鸡卵白蛋白(ovalbumin，OVA)饲料饲养，饲养温度(23±2)℃ ，湿度约为(55.5±10)℃。② 主要药物和试剂：OVA(美国Sigma公司)、生理盐水、AL(OH)3、IL-4突变体(本课题组实验合成)、抗IL-25抗体(上海西唐生物科技有限公司)、ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)。

二、实验动物分组

实验小鼠按随机方法分为5组，每组10只，即对照组、哮喘组、IL-4突变体治疗组、抗IL-25抗体治疗组、联合IL4突变体及抗IL-25抗体治疗组(简称联合治疗组)。

三、哮喘模型制备及干预

各组小鼠(对照组除外)分别于第0天、7天和14天腹腔注射20 ug OVA和20 mg AL(OH)3凝胶与0.9%氯化钠混合液200 μL致敏，对照组腹腔注射相同体积0.9%氯化钠溶液。第21天至第27天将小鼠(对照组除外)置于密闭容器中，超声雾化吸入5% OVA生理盐水诱发哮喘，每天1次，每次30min，其中IL-4突变体治疗组、抗IL-25抗体治疗组及联合治疗组分别于诱发前30min 给予腹腔注射100 μg IL-4突变体、抗IL-25抗体及联合应用IL-4突变体及抗IL-25抗体各100 μg，对照组和哮喘组激发前30 min给予腹腔注射相同体积生理盐水，共7d，对照组用生理盐水代替OVA进行激发。

四、采血及细胞学计数

末次激发24 h后，经小鼠眼球采血，所采血液分为两部分，一部分直接用动物血细胞分析仪检测血液中炎性细胞计数，另一部分血液静置1 h后，经离心机分离3 000 r/min 离心15min留取血清，将血清放于-20℃冰箱中保存备用。

五、细胞因子的测定

采用ELlSA法，检测血清中IL-4、IL-25、IgE水平，操作过程严格按照说明书进行。

六、统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件分析，数据均以计量资料的描述采用均数、标准差。各组数据采用单因素方差分析进行比较，多组之间两两比较采用SNK-q检验的方法;采用P<0.05为差异有临床意义。

结 果

一、各组小鼠外周血中白细胞及嗜酸性粒细胞计数

与对照组相比，哮喘组血液白细胞总数及嗜酸性粒细胞数显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与哮喘组比较，IL-4突变体治疗组、抗IL-25抗体治疗组及联合治疗组白细胞及嗜酸性粒细胞数均显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)；联合治疗组与单纯治疗组比较，白细胞及嗜酸性粒细胞数均进一步下降，差异有统计学意义(P<0.05)，提示联合治疗效果更佳(见表1)。

表1 各组小鼠外周血中白细胞总数及嗜酸性粒细胞数比较

注：与正常组比较，aP<0.001；与哮喘组比较，bP<0.001；与联合治疗组比较,cP<0.001。

二、各组小鼠血清中细胞因子水平

与正常组比较，哮喘组血清中细胞因子IL-4、IL-25、IgE水平明显增高(P<0.01)。与哮喘组相比，IL-4突变体治疗组血清中IL-4水平增高(P<0.05)，IgE、IL-25水平下降(P<0.05)；抗IL-25抗体治疗组IL-4、IL-25、IgE水平均有所降低(P<0.05)；联合治疗组中IL-4、IL-25、IgE水平下降(P<0.05)；联合治疗组与单纯治疗组比较，IL-25、IgE(P<0.05)水平下降更为显著，提示联合组对哮喘小鼠相关细胞因子水平缓解更佳(见表2)。

表2 各组小鼠血清中IL-4、IL-25、IgE水平比较

注：与正常组比较，aP<0.001；与哮喘组比较，bP<0.001；与联合治疗组比较，cP<0.001。

讨 论

哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，主要表现在可逆性的气道受限，气道炎症和气道高反应性，嗜酸性粒细胞及2型细胞因子分泌细胞，包括Th2细胞和2型固有免疫细胞，是过敏性哮喘患者气道慢性炎症的主要组成部分[7]。IL-25是IL-17家族成员，IL-17E，和其他成员不同的是，IL-25主要由Th2细胞产生，且维护2型固有免疫应答[8]，IL-25可直接激活嗜酸性粒细胞，通过提高粘附分子ICAM-1，刺激前炎症因子如单核细胞趋化蛋白1、IL-8，巨噬细胞炎症性蛋白1和IL-6[9]。研究显示，与非哮喘患者及非过敏性的正常受试者比较，无症状的轻度哮喘患者中嗜酸性粒细胞中的IL-17RA和IL-17RB，及血浆中的IL-25表达均明显增高[10]。IL-25刺激的小鼠，Th2型细胞因子IL-4，IL-5及IL-13等细胞因子明显增多，继而IgE、嗜酸性粒细胞增多，上皮细胞增生肥大、粘液分泌增多[11]。研究表明IL-25在哮喘气道募集未成熟嗜酸性粒细胞中发挥重要作用，且IL-25的促炎效果很强，IL-25可能是减轻过敏原诱导的气道反应的有用药物靶标[12]，相反IL-25抗体可减少过敏性哮喘动物模型中气道炎症[13]，IL-25缺失小鼠中肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的数量及促炎症介质的水平明显降低[14]。这与本研究的结果一致，哮喘小鼠中炎性细胞及炎性因子均明显增多，但抗IL-25抗体组的相关炎症细胞及炎症因子均较哮喘组降低，联合治疗组亦降低，均具有统计学意义。

Th2淋巴细胞通过释放细胞因子，尤其是白细胞介素IL-4，IL-5和IL-13，在过敏性哮喘的发病机制中发挥重要作用[15-16]。IL-4导致B细胞形成IgE，IgE介导的肥大细胞活化，在过敏性哮喘的病因中起关键作用[17]。IL-4与其受体的结合导致信号转导和转录激活因子6(STAT-6)的磷酸化，并最终诱导Th2相关转录因子GATA3的表达[18]。GATA3被证实为Th2相关的主转录因子，其诱导Th2细胞中产生IL-4，IL-5和IL-13[19]。研究结果表明[20]，与健康人相比，哮喘患者血清IL-4和GATA3表达水平显著升高，结果证实了哮喘患者的Th2细胞偏向模式与其他研究中获得的数据一致，这些研究显示过敏性哮喘中过量的Th2免疫反应[21]。哮喘患者血清IL-4水平升高和GATA3表达升高证实哮喘患者的Th2细胞偏离，这在过敏性哮喘的发病机制中起着重要作用。IL-4突变体可结合IL-13受体，阻断IL-4受体α及IL-13受体α1，从而阻断IL-4及IL-13的作用[22]。本研究结果显示单药治疗组IgE、IL-25及炎性细胞水平均降低，联合应用效果更明显。而单用IL-4突变体组IL-4水平有所升高，这与之前研究结果基本一致[23]。我们考虑IL-4突变体靶向竞争IL-4受体，使得IL-4无法与受体结合而降解，导致血清中IL-4水平短暂性的增高[24]，推测IL-4将随时间延长而逐渐降低。

综上，本研究利用IL-4突变体及抗IL-25抗体联合干预哮喘小鼠，阻断炎性细胞及炎症因子的聚集，相对于单突变体及单抗体治疗，显著降低了肺部炎性细胞及炎症因子，从而抑制了哮喘小鼠气道炎症的发展，为哮喘的治疗提供一条新的治疗思路。