HPLC测定当归芍药散中的芍药苷和芍药内酯苷的含量*

付 新 ，张洪财 ，张 贺 ，刘 阳 ，王 宇

（1.黑龙江中医药大学 药学院,黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨师范大学 教育学院,黑龙江 哈尔滨 150025）

当归芍药散为传统经典方剂，以往多应用于治疗妇科疾病。当归芍药散为经典古方，最早记载于《金匮要略》中，常用于治疗妇科疾病。当归芍药散以芍药、川芎、当归三味血药，补肝体助肝用；白术、泽泻、茯苓三味水药，健脾土防传变，组方严谨，选药精当，仲景的肝脾同调思想在此方中展现得淋漓尽致，为其调和肝脾的代表方。当归芍药散具有保护神经损伤、增强免疫力、促进神经递质合成和释放、调节激素、改善学习记忆功能等作用[1-3]。最新研究发现当归芍药散活性成分是通过多途径、多环节、多靶点，在神经退行性这种多因素、多病理靶点的复杂性疾病治疗中显示了独特疗效[4]。

芍药苷和芍药内酯苷是当归芍药散的主要成分，具有抗炎、肌肉松弛、镇痛和解痉等作用[5,6]。本研究以芍药苷和芍药内酯苷为指标成分，采用高效液相色谱法（HPLC）测定其中芍药苷和芍药内酯苷的含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

Waters高效液相色谱系统，2695-2998型UV检测器；AB145S型电子天平（上海精密仪器仪表有限公司）；KH3200DB型台式数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

芍药苷和芍药内酯苷对照品（批号分别为110736-201438和110715-201318，纯度依次为98.4%，99.3%）购自中国食品药品检定研究院；芍药、当归、川芎、白术、茯苓、泽泻药材购于哈尔滨同仁堂药店（亳州张仲景中药饮片有限责任公司）；甲醇（色谱纯，迪马科技有限公司）；H3PO4（秦皇岛华瀛磷酸有限公司）；水为娃哈哈纯净水（杭州哇哈哈集团有限公司）。

1.2 色谱条件

色谱柱为COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ柱（4.6×250mm，5μm）；流动相：0.1%H3PO4溶液-甲醇（体积比 86∶14）；检测波长为 230nm；柱温为 30℃；流速为 1mL·min-1。

1.3 溶液的制备

1.3.1 对照品溶液制备 分别精密称取的芍药苷对照品，5.10mg芍药内酯苷对照品，置于容积为25mL容量瓶中，用甲醇进行配置，采用超声溶解，放冷后至室温后，用甲醇定容，即得到单一成分对照品储备液，保存于4℃冰箱。临用时，分别精密量取两种储备液，量定5mL置50mL容量瓶中，得到芍药苷和芍药内酯苷的对照品混合溶液，浓度分别为芍药苷 36.2μg·mL-1，芍药内酯苷 20.4μg·mL-1。

1.3.2 供试品溶液 根据《金匮要略》的记载为参考，分别称取当白芍 30g、当归9g、茯苓 12g、泽泻12g、川芎15g、白术15g，放入粉碎机中粉碎成细粉，再过80目筛，混匀，得到当归芍药散。精密称取当归芍药散粉末0.2g，置于100mL容量瓶中，用甲醇定容，采用超声溶解，滤过，再经过0.22μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。

1.3.3 阴性样品溶液的配制 按处方制备不含芍药的当归芍药散浸膏粉各10g，取适量供试品并按“1.3.2”项下制备方法制备阴性对照溶液。

2 结果与讨论

2.1 专属性考察

参考相关文献[7-11]，经过色谱条件的摸索与优化，采用 0.2%H3PO4溶液-甲醇（体积比 50∶50）等度洗脱的方法。按照1.2项下色谱条件，取供试品溶液和阴性样品溶液进样分析，通过供试品溶液色谱图分析发现，在230nm条件下，对照品溶液芍药苷和对照品芍药内酯苷具有保留时间一致的特征峰，所测样品的色谱峰之间以及和杂质色谱峰分离良好，保留时间分别为13.37和10.86min，而阴性样品无此特征峰，由此可见，供试品中其它药物组分对所测组分并无干扰，如图1所示。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram

2.2 线性关系考察

精密吸取 1.0、2.0、4.0、6.0 和 8.0mL 芍药苷和芍药内酯苷对照品溶液，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容。定容后制备溶液中含芍药苷7.24、14.48、21.72、28.96、36.20μg·mL-1和含芍药内酯苷 4.08、8.16、12.24、16.32、20.40μg·mL-1的标准系列溶液。以峰面积比值为Y，以浓度为X，得到芍药苷和芍药内酯苷的回归方程和相关系数，其回归方程分别为Y=1.7826X-0.4794，相关系数 r=0.9992。Y=1.2368X+0.0304，相关系数 r=0.9998。

2.3 精密度考察

取相同的供试品溶液，按2.1项下色谱条件，连续重复进样5次，测得芍药苷、芍药内酯苷峰面积的相对标准偏差分别为1.63%，1.48%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性考察

取同一新鲜配制好的样品溶液，在 0，2，4，6，8h各进样10μL，测得芍药苷、芍药内酯苷峰面积的相对标准偏差分别为1.43%，1.85%，表明芍药苷、芍药内酯苷在8h内基本稳定。

2.5 重复性考察

取同一供试品6份，按1.3.2项下方法分别制备6份供试品，分别测得芍药苷和芍药内酯苷为4.05，0.77mg·g-1，峰面积的相对标准偏差为 1.67%，1.74%，表明方法重复性良好。

2.6 加样回收率试验

取同一批号当归芍药散样品6份，每份精密称定0.5g，分别加入芍药苷对照品储备液（362.0μg·mL-1）1.5mL，芍药内酯苷对照品储备液（204.0μg·mL-1）4mL，按1.3.2项下方法，分别制备样品溶液。用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按1.2项中色谱条件，测得各被测成分的平均回收率，见表1。

表1 当归芍药散中芍药苷和芍药内酯苷样回收率（n=6）Tab.1 Recovery of Peoniflorin and Albiflorin in Dangguishaoyao-san（n=6）

2.7 样品含量测定

平行不同批号的当归芍药散样品3份，分别按1.3.2项下方法分别制成供试品溶液。取20μL注入高效液相色谱仪测定含量，记录峰面积，分别计算样品中芍药苷和芍药内酯苷的含量。见表2。

表2 当归芍药散中芍药苷和芍药内酯苷的含量测定结果Tab.2 Content of Peoniflorin and Albiflorin in Dangguishaoyao-san

3 结论

当归芍药散化学成分复杂，本实验采用高效液相色谱法同时测定当归芍药散中代表性成分芍药苷和芍药内酯苷的含量，测定方法均比较成熟。并应用该方法测定了3批当归芍药散中上述2种活性成分的含量。结果表明，本法简便，准确可靠，专属性强，稳定性好，重复性好，可用于当归芍药散质量控制，从而保障了当归芍药散的临床疗效。