陆地棉SPL基因家族的全基因组鉴定及表达分析①

钟子达，钟晓真，沈超

( 广东石油化工学院 生物与食品工程学院，广东 茂名 525000)

鳞状启动子结合蛋白样(SPL)是植物特有的一类转录因子，在绿色植物中广泛存在[1]。SPL含有一个高度保守的SBP-box的DNA 结合结构域[2]，SBP结构域专一识别并结合一段以GTAC为核心元件的回文序列[3]，具有2个均含有8个保守的半胱氨酸(Cys)或组氨酸(His)残基的独立锌指结构[4]。

SPL转录因子影响植物的顶芽、花序发育以及开花时间[5]。SPL最初是从金鱼草[6]中发现的，它能识别并结合到SQUAMOSA (SQ-UA)的启动子上，进而参与调控金鱼草早期的花发育和开花过程[7]。研究发现，SPL对植物花和果实的发育、胁迫应答、孢子形成、激素信号传导以及植物阶段转变[8-17]等多种生理生化过程都有一定的调控作用，在植物的生长发育过程中发挥着重要的作用。

棉花是世界上重要的经济作物，也是天然纤维的主要来源。耕地面积的日益减少加剧了粮棉争地的矛盾，培育短季棉品种成为当前一个重要育种目标[18]。开花提前可以缩短生育期，因此研究SPL基因家族，对短季棉育种具有重要促进作用。本研究利用生物信息学方法，对棉花主要栽培种陆地棉中SPL基因家族成员进行鉴定及分析，从全基因组水平解析其基本理化性质、基因数目、基因结构与Motif变化、基因的进化和染色体定位等方面，为进一步探究SPL基因在棉花的成花转变、花发育中的功能和短季棉育种研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 SPL基因的鉴定

在Cotton FGD数据库(https://cottonfgd.org)中下载陆地棉(AD1, HAU)的基因组数据。在Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)下载SPL蛋白的hmm文件，标号为PF03110。使用 HMMER 3.0 软件(http://hmmer.org/)和BLASTP 程序比对含有SBP蛋白结构域的序列。之后，用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)和保守结构域数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行比对验证。

1.2 陆地棉SPL基因家族成员的特性、基因结构与染色体定位分析

利用ExPASy的在线工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam)对陆地棉SPL基因家族成员的氨基酸长度、相对分子质量、等电点、不稳定系数等理化性质进行分析。使用ProtComp9.0 (http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomp-pl&group=programs&subgroup=proloc)预测其亚细胞定位。利用GSDS v2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析绘制其基因结构图。利用MEME (http://meme-suite.org/) 对SPL蛋白保守结构域进行分析，基序最大发现数量设置为10，其他参数为默认值。利用NPSA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)预测蛋白质的二级结构。利用TBtools v0.6731 (https://github.com/CJ-Chen/TBtools-Manual) 定位基因在染色体上的位置。

1.3 多序列比对与系统进化树的构建

利用MEGA 7.0[19]软件对获得的SPL序列进行多重序列比对。基于多序列比对采用最大似然法构建进化树，执行参数 Bootstrap 1000次重复，其他参数为系统默认值。

1.4 陆地棉SPL家族基因的表达模式分析

基于陆地棉RNA-seq数据[20]分析陆地棉SPL基因的表达模式，包括棉花的根、茎、叶、花瓣、花药、柱头和开花后5，10，15，20，25 d的纤维及0，1，3，10，20 d的胚珠等组织。

2 结果与分析

陆地棉SPL基因家族的生物信息学分析主要包括理化分析、系统进化分析等内容。

2.1 SPL家族成员的鉴定和理化分析

最终在陆地棉中鉴定到30个SPL基因(表1)。在陆地棉中，基因的长度为1125～8132 bp，其中Ghir_D13G016090基因最短，为1125 bp，Ghir_A12G013050基因最长，为8132 bp。理化性质分析发现：陆地棉中SPL编码氨基酸的数量为141 ～ 1081，Ghir_A10G002400的氨基酸数量最少，为141，Ghir_A01G009280和Ghir_D01G009680的氨基酸数量最多，为1081，平均为527.9；相对分子质量介于16.11 ～ 119.59 kDa，等电点为5.25～9.88，亚细胞定位表明有6个基因定位到细胞质和细胞核(表1)。

表1 陆地棉中SPL特征

续表

2.2 SPL的系统进化分析

系统发育分析表明：SPL基因家族可以分为6个亚群，同一分支的进化程度相近，亲缘性高，不同亚群中的基因数目不等(图1)。

图1 陆地棉SPL家族基因的进化分析

2.3 SPL基因家族的结构

陆地棉SPL基因家族成员结构的外显子数目为2 ～ 12个，其中Ghir_A10G010450的外显子数目最多，为12个(图2)，进一步分析得到10种保守基序，命名为Motif1—Motif10，每个成员含有3～10个Motif(图3)。系统发育分析发现，同一组内具有相似的外显子数目且具有相似的基因序列结构。

图2 陆地棉SPL的结构分析 图3 陆地棉SPL家族保守基序分析

2.4 SPL基因在染色体上的定位

SPL基因分布在陆地棉18条染色体上(图4)。每条染色体上基因的分布数量不等，A亚基因组的A02、A03、A04、A07和A08以及 D亚基因组的D01、D02、D04和D08染色体上各有1个基因；A亚基因组的A10、A12、A13和D亚基因组的D10、D12、D13染色体上分别有2个基因；A亚基因组的A11染色体有3个基因(图4)。

图4 陆地棉SPL基因家族染色体定位

2.5 SPL的二级结构分析

对陆地棉SPL蛋白的二级结构分析，如表1所示。发现SPL基因家族均含有α螺旋、β折叠、延伸链和无规则卷曲等二级结构原件。无规卷曲的占比最高(除基因Ghir_A01G005270，Ghir_A10G002400，Ghir_D10G003180外)，其次是α螺旋、延伸链和β折叠(表1)。

2.6 SPL基因的表达模式分析

通过对陆地棉SPL在棉花的根、茎、叶、花瓣、花药、柱头和开花后5，10，15，20，25 d的纤维及开花后 0，1，3，10，20 d的胚珠中的表达模式进行分析，分析发现Ghir_D08G004350、Ghir_A08G004140、Ghir_A12G013050、Ghir_D12G013270、Ghir_D01G009680、Ghir_A01G009280、Ghir_A11G011170、Ghir_D11G011120、Ghir_D10G017550这9个基因在组织中的表达量很高(图5)，例如：Ghir_D08G004350在花瓣的表达最高，表明该基因可能参与调控花瓣的生长发育。有些基因的表达量非常低，例如：Ghir_A01G005270除了在根和柱头表达量较高外，在其他组织的表达量很低，甚至不表达。

图5 陆地棉SPL基因家族的组织表达分析

3 结论与讨论

基因组测序技术的发展对基因组研究、转录因子的鉴定与表达分析起到了极大的促进作用。SPL基因家族在许多物种中都得到了深入的研究，表明它们在植物的生长发育过程中发挥了重要作用，并且不同物种的SPL数量也不同。

随着棉花基因组测序的完成与更新，本研究在陆地棉中鉴定30个SPL基因并进一步预测了其理化性质、二级结构及亲缘关系。研究结果表明，陆地棉中SPL相对分子质量为16.11 ～ 119.59 kDa，等电点介于5.25 ～ 9.88。二级结构主要元件为无规则卷曲。聚类分析显示，SPL基因可以分为6个亚组，同一分支的进化程度相近，亲缘性高。结合基因结构和保守基序分析发现，同一组内的SPL基因具有相似的外显子、内含子数目和保守基序，推测其结构域进化和基因的结构多样性相关。基因的染色体定位发现SPL基因并非出现在所有的染色体上。

进一步分析SPL基因的组织表达模式发现，在陆地棉中，Ghir_D08G004350基因可能参与调控花瓣的生长发育。Ghir_A01G005270基因可能与陆地棉的根和柱头的生长发育有关。本研究全面分析了陆地棉SPL的性质特征，表明其在棉花的发育过程中具有重要作用，可为SPL基因后续功能研究提供借鉴。