转化生长因子-β1与乳腺病变弹性特征的相关性

张孟珂，王知力，刘愿，何艳

解放军总医院超声诊断科，北京 100853；*通讯作者 王知力 wzllg@sina.com

乳腺癌居我国女性恶性肿瘤的首位，严重危害女性健康。乳腺癌早期诊断的5年生存率可达95%[1]，因而早期诊断成为迫切需求。多项研究表明，剪切波弹性成像在乳腺病变良、恶性鉴别诊断中发挥重要作用[2-3]；前期研究亦表明，乳腺良、恶性病变的弹性模量值存在差异，且弹性模量值与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中的胶原纤维、弹性纤维含量等密切相关[4-5]，证实ECM 在调控乳腺病变弹性特征的过程中发挥重要作用。而ECM 成分及结构的变化主要是由转化生长因子-β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）调控，TGF-β1的异常表达可促进ECM 中胶原蛋白及纤维蛋白过度沉积，并抑制ECM的降解[6-7]，造成ECM 硬度增加。因此，TGF-β1、ECM、弹性特征之间存在着密切联系。然而，TGF-β1与乳腺病变的弹性特征是否具有相关性目前鲜有报道。本研究拟探讨转化生长因子-β1与乳腺病变弹性特征的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年4—10月于解放军总医院超声诊断科接受超声引导下穿刺活检、旋切活检或手术切除的130例女性患者共135个乳腺病变，患者年龄18～73岁，平均（44±12）岁；病变最大径0.4～5.5 cm，平均（1.6±0.8）cm。所有病变在进行活检或手术切除前均进行剪切波弹性成像检查，并以病理结果为“金标准”。本研究经我院伦理委员会批准，所有纳入患者均签订书面知情同意书。

纳入标准：①病理诊断结果明确；②未接受过新辅助化疗或放疗；③穿刺活检、旋切活检或手术切除；④临床、病理及预后随访信息全面；⑤签订书面知情同意书。排除标准：①接受过新辅助化疗或放疗者；②临床、病理及预后随访信息缺失者。

1.2 剪切波弹性成像 采用SuperSonic Imagine 公司的AixPlorer 实时剪切波弹性成像超声诊断仪，使用L15-4线阵探头，探头频率为4～15 MHz。首先在病变处行常规超声检查，然后转换成剪切波弹性成像模式，探头与皮肤保持垂直缓慢平稳移动以寻找病灶，于病灶处不施压静置3 s 使图像稳定后，冻结并存储图像，继而使用机器自配的定量测量软件选取感兴趣区测量弹性值。选取感兴趣区时应使取样框尽可能覆盖整个病灶大小，尤其是最硬的区域。于病灶的3个不同切面定位测量，分别记录最大弹性模量值、平均弹性模量值、最小弹性模量值，并测量取样框所置病灶处与周围同等深度正常乳腺组织的弹性模量比值，计算这3组数据中最大弹性模量值、平均弹性模量值、最小弹性模量值、病变与周围组织弹性比值的均值，并记录病变边缘有无“硬环征”现象出现。

1.3 TGF-β1 检测 病变组织经福尔马林固定及石蜡 包埋后切成4 μm 厚的切片，然后采用免疫组化法检测TGF-β1。免疫组化染色结果使用Image-Pro Plus 6.0软件进行分析。每张切片于400 倍视野下取5个感兴趣区并拍照，测量集成光密度及面积，计算平均光密度（集成光密度/面积），用平均光密度评价TGF-β1的表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0软件，计量资料以表示，计数资料以百分率（%）表示。采用独立样本t检验比较乳腺良、恶性病变的最大弹性模量值、平均弹性模量值、最小弹性模量值、病变与周围组织弹性比值、TGF-β1表达水平及有无“硬环征”的病变TGF-β1表达水平等的差异；采用χ2检验比较良、恶性病变“硬环征”的发生率；以病理结果为“金标准”，对最大弹性模量值、平均弹性模量值、最小弹性模量值、病变与周围组织弹性比值、TGF-β1 水平、“硬环征”等分别绘制受试者工作特征（ROC）曲线，以曲线下面积（AUC）评估其对乳腺病变良恶性的鉴别诊断效能，并分析截断值、敏感度、特异度，采用Z检验比较各AUC 之间的差异；采用Pearson 相关分析评估TGF-β1表达水平与乳腺病变弹性参数的相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺病变病理结果 135个乳腺病变中，病理结果显示良性84个（62.2%），其中纤维腺瘤32个，腺病40个，导管内乳头状瘤3个，炎性病变8个，良性叶状肿瘤1个；恶性51个（37.8%），其中浸润性癌46个，导管内癌3个，黏液癌2个。

2.2 乳腺良、恶性病变弹性特征分析 乳腺恶性病变的最大弹性模量值、平均弹性模量值及与周围组织弹性比值明显高于乳腺良性病变（P<0.001），但良、恶性病变的最小弹性模量差异无统计学意义（P>0.05）；74.5%（38/51）的乳腺恶性病变具有“硬环征”表现，显著高于乳腺良性病变（4.8%，4/84；P<0.001），见表1及图1、2。最大弹性模量值、平均弹性模量值、病变与周围组织弹性比值及“硬环征”对乳腺良、恶性病变均具有很好的鉴别诊断效能，四者鉴别诊断效能比较，差异无统计学意义（P>0.05；图3，表2）。

2.3 TGF-β1表达水平及与弹性特征的相关性 135个乳腺病变的TGF-β1表达水平为0.176±0.126，乳腺恶性病变的TGF-β1表达水平显著高于乳腺良性病变（0.299±0.011比0.104±0.009，P<0.001），见图1B、2B及表1。以TGF-β1表达水平对乳腺良、恶性病变进行鉴别诊断，其效能为0.934（0.878～0.970），以平均光密度=0.222为截断值时，鉴别诊断乳腺病变良恶性的敏感度、特异度分别为88.2%、89.3%（图3，表2）。TGF-β1表达水平与乳腺病变的最大弹性模量值、平均弹性模量值及病变与周围组织弹性比值呈强正相关（r=0.879、0.821、0.741，P<0.001；图4）。此外，表现为“硬环征”的乳腺病变TGF-β1表达水平显著高于无“硬环征”的乳腺病变（0.308±0.010比0.115±0.010，P<0.001）。

表1 乳腺良、恶性病灶的弹性特征及TGF-β1表达水平（±s）

表1 乳腺良、恶性病灶的弹性特征及TGF-β1表达水平（±s）

指标 良性病灶（n=84） 恶性病变（n=51） t/χ2值 P值 最大弹性模量值（kPa） 58.2±50.5 161.9±79.5 9.276 ＜0.001 ＜0.001 最小弹性模量值（kPa） 15.4±12.9 20.6±19.5 1.434 0.154 平均弹性模量值（kPa） 35.9±26.4 99.6±51.9 9.433 ＜0.001 “硬环征”[例（%）]4（4.8） 38（74.5） 72.030 ＜0.001 病变与周围组织弹性比值 2.1±1.7 6.0±4.1 7.625 TGF-β1表达水平 0.104±0.009 0.299±0.011 13.301 ＜0.001

图1 女，29岁，乳腺浸润性癌。剪切波弹性成像示弹性模量最大值为233.2 kPa，平均值为137.4 kPa，病变与周围组织弹性比值为6.9，可见“硬环征”（箭）出现（A）；免疫组化染色示TGF-β1表达呈强阳性，平均光密度为0.314（×400，B）

图2 女，26岁，乳腺纤维腺瘤。剪切波弹性成像示弹性模量最大值为19.6 kPa，平均值为15.8 kPa，病变与周围组织弹性比值为0.7（A）；免疫组化染色示TGF-β1表达呈弱阳性，平均光密度为0.037（×400，B）

图3 病变的弹性特征及TGF-β1 鉴别诊断乳腺良、恶性病变的ROC曲线

图4 TGF-β1表达水平与病变弹性特征的相关性。A、B、C 分别为TGF-β1表达水平与最大弹性模量值、平均弹性模量值、病变与周围组织弹性比值的相关性（r=0.879、0.821、0.741）

3 讨论

乳腺癌早期发现、早期诊断是有效治疗的关键。目前，剪切波弹性成像在乳腺病变诊断中的重要作用已得到证实[8-9]。前期研究发现，ECM 中的胶原蛋白及弹性蛋白是决定病变弹性的重要因素[4,10]，乳腺癌的发生及发展过程中伴随着ECM 成分及结构的异常变化[11]，而TGF-β1 作为调节ECM 变化的主要因素，其与乳腺病变的弹性特征是否相关目前较少研究。

本研究表明，乳腺恶性病变的最大弹性模量值、平均弹性模值、病变与周围组织弹性比值显著高于良性病变，与既往研究一致[3,12]。这可能是因为乳腺恶性病变在生长过程中癌细胞无限增殖，且不断向周围侵袭乳腺间质及脂肪组织，导致复杂的ECM 反应，进而引起复杂的结缔组织增生及纤维化反应，导致病变硬度增加[13-14]。本研究发现，最大弹性模量值、平均弹性模量值、病变与周围组织弹性比值及“硬环征”均具有很好的鉴别诊断乳腺病变良恶性的效能，进一步证实剪切波弹性成像在诊断乳腺病变中具有重要价值。

TGF-β1 作为TGF-β 超家族中的一员，广泛分布于人体内，可调控组织及器官纤维化、细胞癌变、细胞增殖等多个过程，作用显著[15]。本研究发现，乳腺恶性病变的TGF-β1表达水平显著高于良性病变，这可能是由于恶性病灶在生长过程中癌细胞大量增殖使得TGF-β1 大量活化，TGF-β1表达水平亦大幅提升，而大量表达的TGF-β1 又反过来影响癌细胞的生长，促进其转变成与形成癌症相关的肌成纤维细胞[16-17]，加快病灶生长，从而使TGF-β1表达水平进一步升高。本研究结果还表明TGF-β1 对乳腺良、恶性病变的鉴别诊断效能较佳，提示TGF-β1可能是乳腺癌鉴别诊断的一个新的切入点，为诊断乳腺病变提供新思路。

既往研究表明，乳腺癌病灶生长过程中大量表达的TGF-β1 一方面可促进癌细胞转变成肌成纤维细胞，进而促进胶原蛋白、纤维蛋白等的合成及分泌，从而导致ECM 成分的过度堆积[6,16]，造成ECM 硬度增加；另一方面还可刺激胶原蛋白、弹性蛋白、粘连蛋白等ECM 主要成分的合成及交联重排，并抑制其降解，导致ECM 硬度增加[14,18]，从而使病变“变硬”。此外，TGF-β1 亦可通过促进癌细胞合成并分泌多种蛋白酶类，提高细胞黏附性，使得癌细胞与周围乳腺间质及脂肪组织粘连，导致病变活动性降低，增加病变硬度[19]。本研究显示，TGF-β1表达水平与最大弹性模量值、平均弹性模量值及病变与周围组织弹性比值均呈强正相关，提示TGF-β1 对乳腺病变的硬度有一定的调控作用。

Insana 等[20]研究发现，当乳腺癌细胞在不断向周围侵袭乳腺间质及脂肪组织导致结缔组织增生及纤维化反应时，TGF-β1 亦不断诱导癌细胞转化为肌成纤维细胞，并促使其不断向病灶生长的边缘生长，根据胶原纤维、弹性纤维堆积程度和数目及纤维化反应程度，病灶对其周围组织施予不同程度的拉力[21]。而弹性蛋白和纤维蛋白在拉伸状态下会变硬[22]，从而使得病灶周围组织的硬度增加2～10 倍，因而造成“硬环征”的出现。本研究结果发现乳腺恶性病变“硬环征”的发生率高于良性病变，且具有“硬环征”的乳腺病变TGF-β1表达水平显著高于无“硬环征”的病变，提示TGF-β1与“硬环征”具有相关性。

总之，乳腺病变的TGF-β1表达水平与最大弹性模量值、平均弹性模量值、病变与周围组织弹性比值、“硬环征”等均具有相关性，提示TGF-β1可能在乳腺病变弹性特征的调控过程中发挥重要作用。