双侧颈总动脉闭塞法制作血管性痴呆大鼠模型的行为学动态评估

从 琳, 张智龙

(1. 天津中医药大学, 天津 301617;2. 天津市中医药研究院附属医院, 天津 300120)

血管性痴呆(vascular dementia, VaD)以记忆的缺失和高级认知功能障碍为主要临床表现，现已成为继阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)之后威胁高龄人群的第二大痴呆类型[1]，约占痴呆患者的15%～20%[2]。目前有多种造模方法用于建立VaD动物模型，其中双侧颈总动脉闭塞(bilateral common carotid artery occlusion, BCCAO)法是制作VaD大鼠模型最常用的方法之一[3]。近年诸多实验探讨如何降低BCCAO法制作模型动物的死亡率[4-6]; 但此造模方法制作的VaD大鼠的认知障碍筛选时间在各文献报道中并不统一[7-10]。有学者[11]指出，有必要采用一套包含测试类型和测试时间点的认知评价标准，评估VaD动物模型。因此，本研究以BCCAO法制作VaD大鼠模型，记录术后30 d内的大鼠死亡率；并于术后30～34 d、60～64 d及90～94 d行Morris水迷宫(Morris water maze, MWM)行为学测试, 动态观察BCCAO术后大鼠的认知功能, 以假手术组的逃避潜伏期均值评估BCCAO组大鼠的认知障碍, 尝试探寻评估VaD大鼠认知障碍的适宜测试时间点。

1 材料与方法

1.1 动物及环境

SPF级雄性SD大鼠70只，6～7周龄，体质量(240±10) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[SCXK(京)2016-0006]。饲养于中国医学科学院放射医学研究所动物中心[SYXK(津)2019-0002]，实验动物伦理审查批准编号TCMLAEC2019017。饲养环境室内温度21～25 ℃，相对湿度40%～70%，明暗各12 h光照控制。大鼠自由饮食。

1.2 试剂和仪器

戊巴比妥钠(国药集团化学试剂北京有限公司，69020181)。碘伏消毒液(山东瑞泰奇洗涤消毒科技有限公司，170814)。硫酸庆大霉素注射液(天津金耀药业有限公司，1801141)。MWM设备及视频分析系统(北京众实迪创科技发展有限责任公司，ZS-001)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组方法 大鼠适应性饲养3 d后, 以MWM测试剔除游泳障碍及逃避潜伏期数值极值的大鼠2只，保证实验大鼠智能无明显差异。将68只大鼠随机分为假手术组9只，BCCAO法造模59只。

1.3.2 造模方法 采用2血管阻断法(2-VO法)中的BCCAO法制作VaD模型。大鼠术前12 h禁食, 自由饮水。以0.6%戊巴比妥钠腹腔注射(30 mg/kg)麻醉后，将大鼠仰卧固定于操作台, 颈部备皮, 碘伏常规消毒。切口位于颈部正中, 长度1～1.5 cm,剪开浅筋膜，钝性分离二腹肌后腹、胸骨舌骨肌、胸乳突肌，暴露颈动脉三角。钝性游离颈总动脉和迷走神经，用玻璃分针轻柔地将其分开，注意勿以金属器械损伤迷走神经。以4-0慕丝线结扎双侧颈总动脉，丝线打结牢固，此时可见大鼠呼吸加深加快。切口处滴注硫酸庆大霉素数滴，对齐切口皮肤，3-0手术线缝合3～4针，创口局部碘伏消毒。假手术方法同造模方法，但只分离颈总动脉，不结扎血管。

术中以加热垫保证大鼠体温，维持生命体征平稳。术后将大鼠置于30～35 ℃通风保温箱，待苏醒后送回笼内正常饲养。术后3 d，大鼠自由饮用10%蔗糖水溶液；并碘伏消毒创口后，局部滴注硫酸庆大霉素，以抗感染、降低死亡率。

1.3.3 行为学测试方法 以MWM定位航行试验,考察大鼠的空间学习能力，动态观察BCCAO术后模型大鼠的认知功能。MWM水缸呈圆形，高38 cm，直径120 cm，缸底及内侧壁全部为墨黑色。配一高20 cm，直径12 cm的金属圆柱体，置于缸中作为大鼠逃避平台。配套的系统显示器将水缸从圆心处划为四个象限，圆心正上方配有与计算机相连的摄像头，实时同步记录大鼠的游泳路线轨迹图和各项数据。将金属圆柱体置于缸中某象限近中心处作为平台，向缸中注入清水，使水深没过平台1.5 cm；加少量黑色食品添加剂并搅拌均匀，使从水面观察平台，肉眼不可见；开启设备加热装置，使水温保持在(23±1) ℃。试验全程在暗室进行。

图 1 MWM设备及实验暗室环境Figure 1 MWM equipment and laboratory darkroom environment

每次测试的第一日上、下午，将大鼠分别从水缸两对角象限的缸边放入水中; 后4 d上、下午将大鼠分别从区别于前一日的两对角象限放入水中。设定大鼠搜索到平台的时间(逃避潜伏期)为90 s, 若大鼠90 s内搜索到平台, 并在平台上停留5 s, 则生成逃避潜伏期时间; 若90 s内大鼠未能搜索到平台, 则逃避潜伏期时间为90 s, 此时需人为将大鼠引导至平台停留10 s, 以助其记忆平台位置。3次测试的逃避平台放置于不同象限。

以假手术组大鼠的逃避潜伏期均值为参考值，计算BCCAO组大鼠的平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期比例，该值＞20%者判定为VaD大鼠[7]。

1.4 统计学方法

以SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。计数资料以率(%)表示，根据数据类型，采用χ2检验或Fisher确切概率法检验；计量资料以x- ± s表示，3次检测采用repeated measure ANOVA检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后死亡率

造模当日至术后30 d：假手术组未见死亡大鼠；BCCAO组于手术当日死亡大鼠5只，次日死亡3只，第3日死亡2只，第5日死亡1只，第12日死亡1只，此后至术后30 d未发生大鼠死亡。假手术组共存活大鼠9只，BCCAO组共存活大鼠47只(表1)。经Fisher确切概率法检验，2组死亡率差异无统计学意义(P＞0.05)，说明BCCAO造模方法较为安全。

表 1 术后30 d内大鼠死亡情况及死亡率Table 1 The death count and the mortality rate of rats within 30 days after operation

2.2 行为学测试

2.2.1 平均速度 表2结果显示，随着大鼠的生长，2组大鼠的平均速度均逐渐增快。经repeated measure ANOVA检验，大鼠在3次检测中的平均速度差异有统计学意义(P＜0.05)。平均速度与时间因素无交互作用(P=0.970＞0.05)，表明2组大鼠平均速度随检测时间的走势无差异。在3个检测时间点，2组大鼠的平均速度差异均不具有统计学意义(P＞0.05)，表明较假手术组大鼠，BCCAO组大鼠不存在运动功能障碍，说明BCCAO组大鼠较假手术组大鼠出现的逃避潜伏期差异并非因动力因素造成。

2.2.2 逃避潜伏期 表3结果显示，随着检测次数的增多，2组大鼠的逃避潜伏期均逐渐下降。经repeated measure ANOVA检验, 大鼠在3次检测中的逃避潜伏期差异有统计学意义(P＜0.05)。逃避潜伏期与时间因素无交互作用(P=0.138＞0.05)，表明2组大鼠逃避潜伏期随检测时间的走势无差异。2组大鼠的逃避潜伏期，在术后30～34 d的检测时间点，差异不具有统计学意义(P＞0.05); 在术后60～64 d和90～94 d的检测时间点，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结果表明在BCCAO造模术后30～34 d，BCCAO组大鼠较假手术组大鼠尚未出现明显的认知功能障碍; 而在术后60～64 d及90～94 d的检测中，较假手术组大鼠，BCCAO组大鼠已出现明显的认知功能障碍。

表 2 大鼠3次行为学测试的平均速度Table 2 Average speed of rats in three behavioral tests cm/s

表 3 大鼠3次行为学测试的逃避潜伏期Table 3 Escaping latency of rat in three behavioral tests

2.2.3 VaD成模率 实验观察期间对照组大鼠均未见VaD表现。术后30～34 d, BCCAO组出现VaD表现大鼠15只, 占31.91%。术后60～64 d、90～94 d,出现VaD表现大鼠分别占97.87%和95.65%。表明术后60 d时, BCCAO术后大鼠已基本出现VaD表现。因此建议术后35～60 d筛选模型较为适宜。

3 讨论

反复的脑缺血再灌注和长期慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion, CCH)是VaD的主要病因[12]。经多普勒血流仪测定, BCCAO法可使大鼠的全脑血流量下降70%[13], 造成大鼠CCH, 诱发白质稀疏、海马与皮质神经元损害等病理改变,最终导致大鼠渐进性认知功能障碍。此方法模拟了人类由动脉粥样硬化等慢性病导致的VaD[14]，且操作简单，可重复性强，术后大鼠无明显的感觉和运动功能障碍，因此是近年制作VaD大鼠模型最常用的造模方法之一[3]。

大鼠具有前循环颈内动脉系统与后循环椎基底动脉系统构成的Willis动脉环，双侧颈总动脉结扎后，亦可通过后循环代偿及侧支循环的建立，保证脑部供血[15]; 且价格低廉、易于存活、便于行为学及其他各种检测，因此是以BCCAO法建立VaD模型最为适宜的动物。虽然BCCAO法可对视网膜灌注产生损伤[16,17]，但SD大鼠与Wistar大鼠相比，视觉对行为学产生的影响较小[18], 且在BCCAO术后的死亡率低，体质量恢复良好。文献报道[19]雌激素可降低造模诱导的VaD, 且有学者[20]认为2-VO法以体质量230～270 g大鼠最为适宜。综合文献并结合预实验经验, 本实验最终选择体质量230～250 g雄性SD大鼠作为实验对象。较传统BCCAO的操作方法[4-6], 本实验于术后3 d予大鼠自由饮用10%蔗糖水溶液, 最终BCCAO术后大鼠的死亡率低至20.3%。笔者认为，上述操作或为BCCAO造模方法的有益操作步骤。

MWM行为学测试，由英国心理学家Morris于1981年设计[21]。MWM经不断地改进与应用，现已成为考察大鼠空间学习、记忆能力最为常用的实验装置。水缸内壁均呈墨黑色，实验时于清水中添加黑色食品添加剂，且试验操作全程在暗室进行，配合以SD大鼠为实验对象，避免了由于本造模方法损伤视网膜灌注而可能对行为学产生的影响。

本实验结果显示，BCCAO术后30～34 d至术后60～64 d的2次检测，2组间的逃避潜伏期差异从不具有统计学意义(P＞0.05)到出现统计学意义(P＜0.05)，表明BCCAO术后大鼠的认知功能随时间的进展呈渐进性下降过程；在术后90～94 d的检测中，2组间的逃避潜伏期差异仍具有统计学意义(P＜0.05), 表明至术后90 d左右, BCCAO组大鼠的认知障碍尚未恢复。可以推论，BCCAO术后，模型大鼠的VaD认知障碍于术后35～60 d基本形成，并可持续至术后90 d。以上结果表明BCCAO法制作VaD大鼠模型，可诱发大鼠的认知障碍，并可持续较长时间, 是制作VaD大鼠模型的可靠造模方法。本实验部分证实了先前的文献报道[22-25]，但不完全一致，原因可能为认知的损害程度受大鼠个体差异的影响较大；且实验大鼠的品种、鼠龄、体质量及行为学测试装置不尽相同。

本实验仅以MWM行为学测试动态评估BCCAO术后大鼠的认知功能，后期实验中期望引入以激光多普勒血流仪测定的脑血流量(cerebral blood flow, CBF)等客观指标。通过实验数据可发现, 虽改变了逃避平台的放置象限, 但2组大鼠的逃避潜伏期均持续下降。MWM的设计利用大鼠会游泳但怕水的天性, 对大鼠进行应激性刺激。此MWM检测是否适宜重复进行, 而且较跳台法、避暗法、穿梭箱法、Y-迷宫、八臂迷宫、高架十字迷宫和新事物识别等行为学测试方法, 是否为评估VaD大鼠模型最适宜的方法尚不明确。以期上不足与疑问有待后续实验的探索, 以期进一步完善BCCAO术后VaD大鼠的各项评价标准, 使VaD大鼠模型能够更好地服务于VaD的实验研究。

(致谢: 感谢中国医学科学院放射医学研究所动物中心提供实验动物饲养场地。感谢卢轩师兄进行教学模型制作，杨秀娟师姐协助模型制作，王栩师兄协助MWM行为学测试并指导论文撰写与修改。)