金川雪梨和秦酥挥发性芳香物质的SPME-GC-MS分析

王颖，张文君，李慧冬，丁蕊艳，方丽萍，郭长英，毛江胜，杨亲正，*，陈子雷，3，*

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院，山东济南250353；2.山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，山东济南250100；3.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014）

梨果香气成分是由大量挥发性芳香物质组成的复杂混合物，包括饱和与不饱和烃类、有机酸、酯类、醛类、醇类、酮类、萜烯类、氧化物、硫化合物[1]。香气成分及相互比例决定了不同梨果的特有香气[2]，对确定最佳采收期，品种、产地识别[3]，香气育种，病害防治[4]，以及后续贮藏[5-7]、深加工[8]具有重要指导意义。对梨果香气成分进行分析时，准确鉴定香气成分种类、含量决定着梨果香气的典型性，因此选择优化最佳萃取方法，并进行准确定性定量分析，在香味分析中至关重要。固相微萃取-气相色谱质谱联用（solid phase mi croextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）能实现多组分混合物的高灵敏度，量程宽的一次定量分析，现已成为香气分析最常用的主要手段之一[9]。梨果香气成分差别较大，不同品种间香气物质主成分不同[10]，在进行萃取时，这些差别将导致其在样品基质和纤维头之间的分配系数不同。通过优化可以尽可能实现不同品种梨果香气成分的萃取，满足多种梨果香气分析要求。

白梨系统品种丰富，在我国分布最广，这一品系具有果实大，果肉细脆，味甜多汁，不需后熟即可食用，耐储藏的优良品质[11]。然而白梨大多数气味清淡，相对于香气更为浓郁的洋梨和秋子梨，白梨香气的研究较少。金川雪梨，别名大金鸡腿梨，是西北高原阿坝藏族羌族自治州金川县名优特产，栽培历史悠久。果肉白色，质地细而松脆，汁多味甜，嚼之味浓、馨香，余味悠长。秦酥是1957 年由陕西省果树研究所选育，以砀山酥梨为母本，黄县长把梨为父本杂交培育而成。果实松脆，汁液多，味酸甜适度，无香味[12]。这两种梨都具有典型白梨的优质特点。由此本研究应用固相微萃取、气相色谱质谱联用技术研究白梨中金川雪梨和秦酥香气，以期为白梨的生产、加工、香气育种提供科学依据和理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

梨果：本试验在山东省农科院进行，金川雪梨和秦酥于2017 年10 月25 日分别直采自四川阿坝州金川县咯尔乡金江村和陕西西安，取成熟度一致，大小颜色均一、无虫害机械损伤的果实，于4 ℃冷藏备用，测样前室温（25 ℃）放置一晚。

萃取头 [75 μm 羧乙基/聚二甲基硅烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）、100 μm 聚二甲基硅烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、85 μm 聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）、65 μm 聚二甲基硅烷/二乙烯苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）、50/30 μm 二乙烯苯/羧乙基/聚二甲基硅烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）]：美国色谱科公司；DB- 5 MS（30 m×250 μm×0.25 μm）色谱柱：美国安捷伦公司。

乙酸丁酯（99.0%）、苯甲醛（99.3%）：北京曼哈格公司；（E）-乙酸-2-己烯-1-醇酯（98%）：上海阿拉丁试剂公司；辛酸乙酯（98%）：上海梯希爱化成工业公司；壬醛（96%）：萨恩化学公司；己酸甲酯（99.5%）、乙酸戊酯（99.0%）、苯甲酸乙酯（99.0%）、反-4-癸烯酸乙酯（95%）、乙酸庚酯（98%）：北京百灵威公司；戊酸乙酯（99.5%）、己酸乙酯（99.3%）、2-壬酮（99.0%）；德国 Dr.Ehrensorfer 公司；甲醇（HPLC 级）：美国 Fisher公司。

1.2 仪器

SUPELCO 固相微萃取装置：美国色谱科公司；CORNING PC-420D 磁力搅拌器：美国康宁公司；sar torius BSA224S-CW 分析天平：德国赛多利斯公司；GCMS：Agilent 7890 A 气相色谱仪（配备 Agilent 5977 MSD质谱仪）：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 标样配置

称取0.1 g（精确至0.000 1 g）香气标准品，用甲醇定容至10 mL，配制成10 000 mg/L 的标准储备液；不同浓度混标液配制：将内标物2-壬酮用甲醇稀释至1 000 mg/L 备用；其他12 种标准溶液用甲醇稀释至500 mg/L 混标备用；然后用甲醇稀释高浓度混标为5、10、20、50、100、200 mg/L，2-壬酮的浓度保持在200 mg/L；所有标准溶液于-18 ℃冰箱中贮存。

1.3.2 气相色谱质谱条件

色谱条件：色谱柱为DB-5 MS（30 m×250 μm×0.25 μm），载气为高纯氦气，流速为1 mL/min。柱子的起始温度为30 ℃，保持2 min；以3 ℃/min 的速度升至102 ℃，以 2 ℃/min 的速度，升至 126 ℃，以 1 ℃/min 的速度，升至 148 ℃，以 4 ℃/min 的速度，升至 190 ℃，再以10 ℃/min 的速度，升至270 ℃并保持3 min。进样口、检测器和连接杆温度分别是270、270、280 ℃。

质谱条件：质谱为EI 离子源，电子能量70 ev，全扫描方式，扫描范围为45 amu～450 amu，离子源温度230 ℃。

1.3.3 固相微萃取头对香气成分萃取效果的影响

以金川雪梨为试材，采用单因素优化方法，比较50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS、85 μmPA 5 种萃取头对梨果香气成分的萃取效果，确定最佳萃取纤维头。

1.3.4 不同萃取温度及时间对萃取效果的影响

以金川雪梨为试材，温度梯度设置为30、35、40、45、50 ℃，比较芳香成分萃取效果，确定最优萃取温度。萃取时间梯度设置为 20、30、40、50、60 min，确定最优萃取温度。

1.3.5 金川雪梨和秦酥香气成分分析

取金川雪梨和秦酥，按照四分法将每个梨果划分为4 部分，分别从每个部分竖切0.5 cm 厚的梨片，去掉核果，每次取5 个梨果上果肉，带皮切成0.5 cm×0.5 cm梨块，混合均匀，取6 g 装入顶空瓶中，加入50 μL 200 mg/L 2-壬酮于梨块上，盖紧塞子静置10 min，在40 ℃条件下萃取40 min，每个样品重复试验3 次。

各组分经过计算机检索同时与NIST11 谱库检索（匹配度达到80%以上的芳香物质）及资料分析以确定其化学成分进行定性方法。

以2-壬酮作为内标，通过峰面积归一化法计算相对含量。组分含量/（μg/kg）=[各组分的峰面积/内标的峰面积×内标浓度/（g/L）×50 μL]×1 000/样品量/（g），进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 萃取条件的优化

由于感官互作（sensory interaction），梨果的香气浓郁程度与香气的成分和含量紧密相关[13]。金川雪梨比秦酥香气更为浓郁，香气成分更为复杂，以金川雪梨为试材优化萃取条件，更有利于全面测定各种香气成分。试验以金川雪梨为试材，采用单因素优化方法，按照先后顺序对萃取头类型、萃取温度、萃取时间等3 个因素进行试验，测定金川雪梨中香气成分含量和种类，以确定最佳试验条件。

2.1.1 萃取头的优化

75 μm 羧乙基/聚二甲基硅烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）（双极性），100 μm 聚二甲基硅烷（polydimethylsiloxane，PDMS）（非极性），85 μm 聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）（极性），65 μm聚二甲基硅烷/二乙烯苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）（双极性偏非极性），50/30 μm 二乙烯苯/羧乙基/聚二甲基硅烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）（双极性），5种萃取头对香气萃取效果的影响见图1。

图1 萃取头对萃取效果的影响Fig.1 Influence of the extraction head on the extraction effect

将各种萃取头萃取的香气进行比较，从图1 A 可以看出 50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 萃取头萃取的含量显著高于100 μm PDMS 和 85 μm PA 这两种单极性萃取头；从图1 B 可以看出 50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 对应萃取的香气成分种类较多，明显高于单极性萃取头。50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头测得的香气种类最多，含量也相对较高。为了全面测得梨果内所有香气成分，本试验选用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头。

2.1.2 不同萃取温度及时间对萃取效果的影响

升高温度有利于半挥发物质的提取和挥发物质从基质更有效的释放。不同萃取温度和时间对香气萃取效果的影响见图2。

图2 萃取温度和时间对萃取效果的影响Fig.2 Effect of extraction temperature and time on the extraction effect

不同的物质具有不同物化特性，吸附的难易程度不同，达到平衡所需时间有所区别[14]。从图2 A 可以看出，乙酸己酯和α-法尼烯随温度变化显著，其他物质趋于平缓，（E）-乙酸-2-己烯-1-醇酯、2-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯随温度升高略有下降，35 ℃和40 ℃萃取的酯类含量相对较高，这可能与各物质物化特性有关；从图2 B 可以看出，45 ℃和50 ℃萃取的香气种类最多，30 ℃和40 ℃次之，35 ℃萃取的香气种类最少。但是从试验过程中表观现象分析，45 ℃时顶空瓶梨果贴壁部分轻微褐变，50 ℃时褐变更为严重且伴有煮熟的气味，此时梨果香气成分可能已发生质变，所以不予考虑。30 ℃时虽然萃取香气种类多，但是酯、醛、醇类数量较少，烷烃类较多，推测样品中的香气未完全释放，35 ℃以后酯类开始逐渐增多。综合以上分析，为了尽可能测出自然状态下的所有香气成分，选择40 ℃作为萃取吸附温度。

在其他萃取条件一致的条件下，香气物质在梨块基质与萃取头涂层间达到吸附与解吸动态平衡时，可达到最大吸附效果，萃取时间长短，取决于香气物质本身的性质。从图2 C 可以看出正己酸乙酯、丁酸乙酯、（E）-乙酸-2-己烯-1-醇酯、2-甲基丁酸乙酯吸附40 min 时含量相对最高，其他酯类含量波动较小，α-法尼烯随吸附时间延长逐渐增多。从图2 D 可以看出，40、50、60 min 萃取香气种类相差较小，萃取时间过长可能导致梨块基质内代谢异常，综合图2 C 的分析，选择40 min 为最佳吸附时间。

2.2 基质标准曲线与添加回收试验

2.2.1 基质标准曲线

按照1.3.5 试验方法，以空白秦酥梨块为对照，分别加入 5、10、20、50、100、200 mg/L 的混标溶液 50 μL，按照已建立方法考察5mg/L～200 mg/L 的范围内线性，每个样品重复3 次。以标样中各组分的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，标样组分浓度与内标浓度之比为横坐标，作线性回归，各芳香成分基质标准曲线见表1。

表1 方法线性范围、回归方程及相关系数Table 1 Linear range，regression equation and correlation coefficient of the method

续表1 方法线性范围、回归方程及相关系数Continue table 1 Linear range，regression equation and correlation coefficient of the method

由表1 可见，在梨块基质中，各物质在5 mg/L～200 mg/L 的范围内线性良好，相关系数R2均大于0.99。经计算各物质的最小检出限小于2.44×10-3ng。

2.2.2 添加回收试验

秦酥梨块样品中分别添加20 mg/L 的混标溶液50 μL，按照已建立方法考察方法的回收率及重复性，每个样品重复5 次，分析结果见表2。

表2 12 种芳香成分回收率及相对标准偏差Table 2 12 recoveries and relative standard deviations of aromatic compounds

由表2 可见，各标准物质在梨块中添加回收率分别为89.3%～101.4%之间，相对标准偏差分别在1.6%～7.9%之间，均满足定量定性分析的要求。

2.3 梨果实挥发性香气物质的气相色谱-质谱联用分析

2.3.1 不同梨果挥发性香气物质组成分析

本试验在固相微萃取测试条件下，对梨块选用50/30 μm 二乙烯苯/羧乙基/聚二甲基硅烷涂层萃取头，在40 ℃萃取40 min 进行了检测。白梨体系金川雪梨和秦酥果实挥发性香气物质总离子流图见图3。

图3 梨果挥发性香气物质的总离子流图Fig.3 Total ion current chromatogram of volatile aroma substances from pear fruits

对总离子流图的峰进行积分，经过计算机检索同时与NIST11 谱库检索（匹配度达到80 %以上的芳香物质）对挥发性香气物质进行分析。结果表明，香味浓郁的金川雪梨挥发性香气物质含有32 种酯类（81.67 %），1 种醛类（0.02%），1 种醇类（0.03%），4 种烷类（0.21%），13 种烯烃类（17.24%），12 种其他类（0.8%），共计63 种。香气弱的秦酥挥发性香气物质含有 21 种酯类（49.1%），2 种醛类（0.2%），1 种醇类（1.47 %），7 种烯烃类（44.18%），8 种烷类（2.15 %），7种其他类（2.73%），共计 46 种。

金川雪梨中含量超过1%的挥发性香气物质有乙酸己酯（33.90%），α-法尼烯（15.83%），己酸乙酯（13.54%），丁酸乙酯（11.46%），（E）-乙酸-2-己烯-1-醇酯（6.25 %），辛酸乙酯（4.35 %），惕各酸乙酯（2.09 %），2-甲基丁酸乙酯（1.97 %），乙酸乙酯（1.37 %）。秦酥中含量超过1%的挥发性香气物质有α-法尼烯（42.04%），乙酸叶醇酯（22.86%），乙酸己酯（15.13%），邻苯二甲酸二异丁酯（3.14%），己酸乙酯（2.11%），（Z，E）-a-Farnesene（1.57%），叶醇（1.47%），丁酸己酯（1.07%）。

2.3.2 梨果特征香气物质

人的嗅觉器官对香气值小于1 的挥发性香气物质没有感觉，特征香气是指香气值大于1 的成分，可以决定某种风味。香气值的大小取决于挥发性香气物质的含量与该物质的香气阈值，香气值越大，表明该挥发性香气物质对梨果风味贡献越大，香气越浓郁。金川雪梨和秦酥的特征香气的含量及香气值见表3。

通过峰面积归一化法计算金川雪梨和秦酥香气成分含量，根据已报道的香气阈值计算方法，通过香气浓度与香气阈值的比值来获得香气值。结果显示，这两种梨共有的特征香气成分为乙酸己酯和己酸乙酯。金川雪梨的特征香气成分有乙酸己酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、辛酸乙酯、（E）-乙酸-2-己烯-1-醇酯、乙酸乙酯、庚酸乙酯、惕各酸乙酯，秦酥的特征香气成分有乙酸叶醇酯、乙酸己酯、己酸乙酯。

表3 金川雪梨和秦酥的特征香气的含量及香气值Table 3 Characteristic aroma and aroma value of Jinchuanxue pear and Qinsu

3 讨论

水果中的香气物质包括键合态香气物质和游离态香气物质。键合态香气物质如：糖苷键合态香气物质，不具挥发性，是以糖苷形式存在的香气前体物质[20]。游离态的香气物质，也即挥发性香气物质，其种类和含量是梨果风味品质的重要指标，但是不易收集，因此，挥发性物质的萃取收集在其测定中成为至关重要步骤。固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME）能对梨果挥发性成分吸附萃取，不需要过高的温度或有机溶剂[21]，有利于保持梨果新鲜度，从而更全面检测挥发性物质。为保证最佳萃取效果，需要对萃取条件进行优化，陈记峦等[22]对库尔勒香梨香气萃取研究，优化萃取头（聚二甲基硅烷涂层和聚丙烯酸酯涂层），萃取温度（30、40、50、60 ℃），萃取时间（10、20、30、40 min）和电解质浓度，确定聚二甲基硅烷萃取头在40 ℃下萃取30 min 为最佳萃取条件，并分离出43 种香气；李国鹏等[23]对库尔勒香梨萃取研究，优化萃取头（100 μm聚二甲基硅烷涂层，75 μm 羧乙基/聚二甲基硅烷涂层，65 μm 聚二甲基硅烷/二乙烯苯涂层），萃取温度（40、50、60 ℃），萃取时间（15、30、45、60 min），确定65 μm 聚二甲基硅烷/二乙烯苯涂层萃取头在40℃下萃取45 min 为萃取条件。在前人研究的基础上，本试验选用萃取头类型更为齐全，温度和时间跨度更广，最终选用50/30 μm 二乙烯苯/羧乙基/聚二甲基硅烷涂层萃取头在40 ℃下萃取40 min 为萃取条件，并且进一步用基质加标和添加回收试验验证了方法的灵敏度和重复性，可以满足金川雪梨和秦酥香气成分分析要求。

田长平等[24]分析了商熟期白梨香气特点，提出在梨新品种品质评价和选育中，着重商熟期的香气组成及其质量分数，优先选择己醛、1-己醇及乙酸己酯等特征香气成分多的品种；伊兴凯等[25]研究比较砀山梨、香面梨、木头酥香气成分，发现香面梨和木头酥对白梨香气品质的遗传改良有很大潜力。本文对金川雪梨和秦酥香气进行分析，发现酯类是这两种白梨香气主要成分，金川雪梨特征香气较秦酥更为丰富，这与金川雪梨更为浓郁的香气感官相符。目前尚没有对白梨品系金川雪梨和秦酥香气的报道，本文可以为白梨香气成分的研究提供一定的数据基础。

4 结论

本试验应用固相微萃取和气质联用技术建立白梨中挥发性芳香物质的分析方法，经评价该方法可行，能够进一步为挥发性芳香物质科学分析提供一定理论支持；应用此方法对不同白梨品种进行香气评价，确定金川雪梨和秦酥主要香气成分及特征香气成分，通过比较发现，特征香气成分因品种不同而有不同程度的差异，经计算获得的香气值可以为梨果育种的发展提供一定的数据支持。