EGCG与乳清蛋白相互作用的光谱分析

吴云雪，李娟，高晴，董文明，和劲松

（云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201）

茶多酚是茶叶中有保健功能的主要成分，其中儿茶素类约占茶多酚总量的60%～80%[1]。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是茶叶中含量最为丰富的一种儿茶素，约占茶叶中总儿茶素含量的50%～60%[2]，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌消炎、预防心脑血管疾病等活性，但稳定性差的特点导致其生物利用率较低[3]。乳清蛋白是牛乳蛋白的主要成分之一[4]，将乳清蛋白高度浓缩可制得乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI），其蛋白质含量在90%以上[5]，是公认的人体优质蛋白质补充剂之一。

食品中不同成分之间发生的相互作用会影响食品的营养、质地、安全性等，茶多酚与蛋白质的相互作用会影响茶多酚的抗氧化活性以及蛋白质的功能特性。Mariana 等[6]发现乳清蛋白会影响绿茶的抗氧化活性和抑菌性。Avi 等[7]发现蛋白质与茶多酚的相互作用能够提高茶多酚的稳定性。徐洁琼等[8]发现蛋白质空间结构的变化可影响其与茶多酚的相互作用。关于EGCG 与乳清蛋白间相互作用的研究未见报道。本试验利用紫外吸收光谱、导数光谱、荧光光谱研究EGCG与WPI 间的相互作用，以期为功能食品的开发以及茶多酚在蛋白食品中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清分离蛋白粉（蛋白质含量＞95%）：美国Le Sueur Cheese 公司；EGCG（纯度 98%）：成都普瑞法科技开发有限公司；所用分析用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

XK96-A 型快速混匀器：姜堰市新康医疗器械有限公司；FE20 型实验室2、3 计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UPG-752 紫外可见分光光度计：北京优谱通用科技有限公司；F96Pro 型荧光分光光度计：上海棱光技术有限公司；601 型恒温水浴锅：江苏省金坛市医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

用柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠配制不同pH（pH 范围2.0～9.0、离子浓度为0.10 mol/L）和不同离子浓度（pH 为 3.0、离子浓度范围 0.10 mol/L～0.20 mol/L）的磷酸盐缓冲液，并以此为溶剂配制浓度为1.0 mg/mL的WPI 溶液，以及浓度为1.2 mg/mL 的EGCG 溶液。

1.3.2 光谱分析

1.3.2.1 紫外-可见吸收光谱分析

向试管中依次加入2.0 mL 磷酸盐缓冲液，2.0 mL 1.0 mg/mL WPI 溶液和一定量1.2 mg/mL EGCG 溶液，用磷酸盐缓冲液补充至5.0 mL，在25 ℃恒温水浴锅中保温1 h 后取出，扫描260 nm～340 nm 波长范围内的紫外吸收光谱；对吸收曲线求二阶、四阶导数，得到相应导数光谱。

1.3.2.2 荧光光谱分析

配制上述溶液，选择激发波长280 nm、扫描速率3 000 nm/min，测定其在280 nm～440 nm 波长范围内的荧光发射光谱，激发和发射狭缝宽度5 nm/5 nm。

溶液中WPI 作为荧光物质分子和猝灭剂EGCG分子发生相互碰撞引起的荧光猝灭过程由Stern-Volmer 方程描述[9]：

式中：F0和F 分别是不存在和存在猝灭剂时WPI溶液的荧光强度；[Q]为猝灭剂浓度，mol/L；Ksv为Stern-Volmer 猝灭常数，L/mol；Kq为双分子猝灭速率常数，L/（mol·s）；Ksv=Kq×τ0；τ0为不存在猝灭剂时荧光分子的寿命，生物大分子的平均寿命约为1×10-8s[10]。

当荧光体为生物大分子时，其最大扩散碰撞猝灭常数为2×1010L/（mol·s），将经公式（1）计算得到的Kq与之比较，若Kq＞2×1010L/（mol·s），则属于静态猝灭；若Kq＜2×1010L/（mol·s），则属于动态猝灭。

对于静态猝灭，可采用下式计算结合常数KA和结合位点数n[11]：

式中：F0和F 分别是不存在和存在猝灭剂时WPI溶液的荧光强度；KA为表观结合常数，L/mol；n 为结合位点数；[Q]为猝灭剂浓度，mol/L。

通过log[（F0-F）/F]和log[Q]作图可求出结合常数KA和结合位点数n。

1.3.3 数据统计分析

应用Origin Pro 8.5.1 软件进行绘图，本文采用SPSS 19 软件对试验数据进行分析，结果以平均值±标准差表示，每个试验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 EGCG对WPI紫外吸收光谱的影响

紫外吸收光谱是研究蛋白质结构变化的一种简单可靠的方法[12]。小分子与蛋白质的相互作用会引起蛋白质吸收谱的红移与蓝移，或信号的增强与减色。图1 显示了pH 值为7.0、离子浓度为0.10 mol/L 和pH值为3.0、离子浓度为0.15 mol/L 条件下不同浓度EGCG 对WPI 紫外吸收光谱的影响。

图1 不同浓度EGCG 对WPI 溶液紫外吸收光谱的影响Fig.1 Effect of EGCG concentration on the UV-Vis absorption spectrum of WPI

如图1，当 WPI 溶液中不含 EGCG 时，WPI 在 280 nm附近有最大吸收峰，随着WPI 溶液中EGCG 浓度的增加，WPI 的紫外吸收光谱峰值随之增大，并且发生蓝移，最大吸收峰波长由280 nm 移至276.4 nm。此外，在离子浓度为0.10 mol/L，不同pH 值（分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0）条件下以及 pH 值为 3.0，不同离子浓度（分别为0.10、0.20 mol/L）条件下均观察到类似现象，如图2、图3。

孟丽艳等[13]研究了大黄酚与牛血清白蛋白的相互作用机制，发现加入大黄酚可使牛血清白蛋白的紫外吸收光谱发生明显的变化。刘勤勤等[14]研究了茶多酚对大豆分离蛋白紫外吸收光谱的影响，发现大豆分离蛋白的紫外吸收光谱峰值随加入茶多酚浓度的增加而升高，并且发生蓝移。本研究结果与上述基本一致，表明加入EGCG 可使WPI 生色团所处的微环境发生改变，进而导致WPI 吸光度增大。

图2 不同pH 值条件下，不同浓度EGCG 对WPI 溶液紫外-可见吸收光谱的影响Fig.2 Effect of different concentration EGCG on the UV-Vis absorption spectra of WPI at different pH

图3 不同离子浓度条件下，不同浓度EGCG 对WPI 溶液紫外-可见吸收光谱的影响Fig.3 Effect of different concentration EGCG on the UV-Vis absorption spectra of WPI at different ion concentration

2.2 EGCG对WPI导数光谱的影响

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是天然氨基酸中仅有的在近紫外光区具有吸收光谱的3 种组分，但由于它们在240 nm～300 nm 范围内的吸收峰会发生重叠[15]，因此选用高灵敏度、高分辨率和具有良好再现性的导数光谱法[16]进一步探究EGCG 对WPI 结构的影响。不同浓度EGCG 对WPI 溶液导数光谱的影响见图4。

图4 不同浓度EGCG 对WPI 溶液导数光谱的影响Fig.4 Effect of EGCG concentration on the derivative spectrum of WPI

由图4 可知，WPI 的四阶导数光谱在284 nm 和291 nm 附近有两个尖锐的波峰，分别是酪氨酸和色氨酸的特征重叠峰以及色氨酸的特征吸收峰[17]，随着加入EGCG 浓度的增大，这两种峰的位置发生了变化。当pH 值为7.0、离子浓度为0.10 mol/L 时，分别由284.6 nm 和 291.5 nm 移至 284.8 nm 和 291.6 nm 处；当pH 为3.0、离子浓度为0.15 mol/L 时，分别由281.1 nm和287.9 nm 移至281.9 nm 和287.7 nm 处。同样地，WPI 的二阶导数光谱在284 nm 和291 nm 附近相应位置处有这两种氨基酸的负吸收峰。随着加入EGCG 浓度的增大，对应特征峰的位置发生了类似的变化。当pH 为7.0、离子浓度为0.10 mol/L 时，分别由284.1 nm和 291.7 nm 移至 284.2 和 291.6 nm 处；当 pH 为 3.0、离子浓度为0.15 mol/L 时，酪氨酸和色氨酸的特征重叠峰的位置由284.1 nm 移至283.7 nm 处，而色氨酸特征峰波长则无明显变化。在离子浓度为0.10 mol/L，不同pH（分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0）条件下以及pH 为 3.0，不同离子浓度（分别为 0.10、0.20 mol/L）条件下均观察到两种峰位变化的类似现象（图略）。

宁爱民等[18]利用导数光谱研究了牛血清白蛋白与十二烷基硫酸钠的相互作用，发现随着十二烷基硫酸钠浓度的增大，牛血清白蛋白分子中芳香族氨基酸微环境极性的变化趋势不同。本研究结果进一步表明，EGCG 通过影响WPI 分子中酪氨酸和色氨酸所处的微环境使WPI 分子构象发生改变，紫外吸收发生明显变化，EGCG 与WPI 之间存在相互作用。

2.3 EGCG对WPI荧光光谱的影响

蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸能够发射荧光，含有这3 种氨基酸的蛋白质均属于内源性荧光物质，因此荧光光谱法常被用于探究蛋白质与小分子间的相互作用。在280 nm 激发波长下，色氨酸和酪氨酸均能发射荧光，但当激发波长为295 nm 时，只有色氨酸能够发射荧光[19]。不同浓度EGCG 对WPI 溶液荧光发射光谱的影响见图5。

由图5 可知，当激发波长为280 nm 时，WPI 在波长330 nm 附近发射荧光。固定WPI 溶液浓度不变，向其中加入EGCG，结果表明随着EGCG 浓度的增加，WPI 的内源荧光强度逐渐降低，最大发射波长发生轻微移动。在离子浓度为0.10 mol/L，不同pH 值（分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0）条件下以及 pH 为 3.0，不同离子浓度（分别为0.10 mol/L、0.20 mol/L）条件下均观察到相同现象，这说明EGCG 对WPI 的内源荧光有猝灭作用。

图5 不同浓度EGCG 对WPI 溶液荧光发射光谱的影响Fig.5 Effect of EGCG concentration on fluorescence emission spectrum of WPI

2.4 荧光猝灭机制分析

根据不同pH 值和不同离子浓度条件下WPI 的荧光猝灭光谱，绘制F0/F 随[Q]变化的Stern-Volmer 关系图，经线性拟合得图6，由图中直线的斜率可计算出EGCG 与 WPI 相互作用的 Ksv和 Kq，结果见表1、表2。

图6 不同pH 值和不同离子浓度条件下EGCG 猝灭WPI 的Stern-Volmer 曲线图Fig.6 Stern-Volmer plots of WPI quenched by EGCG at different pH and different ion concentrations

表1 不同pH 值条件下EGCG-WPI 复合物的荧光猝灭常数及线性相关系数Table 1 Quenching rate constants and correlation coefficients of EGCG and WPI at different pH

表2 不同离子浓度条件下EGCG-WPI 复合物的荧光猝灭常数及线性相关系数Table 2 Quenching rate constants and correlation coefficients of EGCG and WPI at different ion concentrations

由图6 可知，EGCG 对 WPI 的 Stern-Volmer 曲线大部分呈非直线关系（R2＜0.98），表明 EGCG 对 WPI 的猝灭机制并不完全是动态猝灭，且双分子猝灭常数都在1013L/（mol·s）数量级（表1、表2），均远大于最大散射碰撞猝灭速率常数2×1010L/（mol·s），说明EGCG 对WPI 的荧光猝灭机制属于生成了不发光复合物的静态猝灭。

在不同pH 值条件下，Stern-Volmer 猝灭常数随pH 值的增大呈现先减小后增大的趋势。这可能与pH值影响蛋白质分子表面电荷量有关，β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要成分，等电点在5.13 附近[20]，此时蛋白质分子表面不带电荷，因此pH 5.0 时Stern-Volmer 猝灭常数最小。在不同离子浓度条件下，Stern-Volmer 猝灭常数随离子浓度的增大而增大，这可能是因为增大离子浓度能够屏蔽静电排斥作用，但不会影响EGCG 与WPI 之间的静电吸引作用，导致EGCG 与WPI 之间的吸附量增加。由此推测在EGCG 与WPI 的相互作用中存在静电作用力。

2.5 EGCG与WPI结合常数和结合位点数的计算

根据公式（2），绘制lg[（F0-F）/F]随lg[Q]变化的双对数关系图，经线性拟合得图7，由直线截距和斜率可计算出EGCG 与WPI 间相互作用的表观结合常数KA和结合位点数n，结果见表3、表4。

表3 不同pH 值条件下EGCG-WPI 复合物的表观结合常数、结合位点数及线性相关系数Table 3 Apparent binding constants，binding sites numbers and correlation coefficients of EGCG and WPI at different pH

表4 不同离子浓度条件下EGCG-WPI 复合物的表观结合常数、结合位点数及线性相关系数Table 4 Apparent binding constants，binding sites numbers and correlation coefficients of EGCG and WPI at different ion concentrations

如图7 所示，EGCG 对WPI 猝灭的双对数图呈现出较好的线性关系。不同条件下EGCG 与WPI 的结合位点数 n 均在 1 左右（表3、表4），说明 WPI 仅提供一个位点与EGCG 结合。在不同pH 值条件下，结合常数KA随pH 值的增大呈现先减小后增大的趋势；在不同离子浓度条件下，结合常数KA随离子浓度的增大而增大，进一步表明EGCG 与WPI 的相互作用中存在静电作用力。

3 结论

EGCG 可改变WPI 分子中芳香族氨基酸的微环境，使WPI 的分子构象发生改变，并能有规律的猝灭WPI 的内源荧光，猝灭机制为静态猝灭，二者形成了复合物，结合位点数约为1。pH 值和离子浓度都是影响EGCG 与WPI 相互作用的外界因素，EGCG 与WPI结合常数在pH 2.0～9.0 范围内随pH 值的增大先减小后增大，在离子浓度0.10 mol/L～0.20 mol/L 范围内随离子浓度的增大而增大，基于以上可知，EGCG 与WPI间存在静电相互作用。