超声波提取沙棘叶总黄酮的工艺优化试验研究
2020-03-09刘英翠张春媛梁爱军
刘英翠，张春媛，梁爱军，史 鹏，马 倩
(山西省林业和草原科学研究院， 山西 太原 030012)
我国是沙棘分布面积最大、种类最多的国家。沙棘已被列入药食同源植物，富含多种营养成分和黄酮类等生物活性物质。现代医学研究证实，沙棘黄酮具有抗心肌缺血、降低血清胆固醇、降血糖、降血脂、抗氧化等药理功效。据报道沙棘叶中黄酮含量最高，而对沙棘叶利用的研究较少，为了充分利用沙棘资源，对沙棘叶中总黄酮的提取及深加工利用进行研究具有重要意义。
目前，总黄酮的提取方法主要有索氏提取法、有机溶剂回流法、微波法等，这些方法存在溶剂使用量大，操作繁琐、提取率低等缺点。利用超声波产生的强烈振动、搅拌作用、空化效应等可加速有效成分的溶出、扩散，从而缩短提取时间，增加提取率，节约溶剂，避免高温加热萃取对黄酮成分的影响，最大程度保持沙棘黄酮的生物活性。笔者在传统高温加热超声提取方法的基础上，通过正交优化试验得出低温加热或常温超声条件下提取沙棘叶总黄酮的最佳工艺条件，保证了沙棘叶总黄酮的生物活性。该方法具有操作简单、节约能耗、效率高等优点，可为提取沙棘叶黄酮类化合物的工业化生产提供依据。
1 试验材料
1.1 材料与试剂
试验所用沙棘叶采于山西省右玉县。试验试剂包括芦丁标准品(≥98%，成都曼思特生物科技有限公司)、蒸馏水、乙醇(95%)，亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等分析纯。
1.2 仪器与设备
电子天平(BSA223S-CW)、紫外可见分光光度计(UV-3100PC上海美谱达)、超声波清洗机(SB-25-12DTDN)、电热恒温鼓风干燥箱(上海博迅)、粉碎机、抽滤泵。
2 试验方法
2.1 原料预处理
挑选沙棘叶，去刺，整理后于60 ℃条件下恒温烘干，用食品研磨机研磨，过60目筛，得到干燥的沙棘叶粉末，密封待用。
2.2 标准溶液的制备
精密称取芦丁对照品20 mg，加适量60%乙醇，水浴溶解后放冷，转移到50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，摇匀。精密量取25 mL溶液，置于50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得芦丁对照品溶液，浓度为0.2 mg/mL，储存于4 ℃冰箱中备用。
2.3 标准曲线和回归方程
精密量取芦丁对照品溶液0.3 mL，0.6 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，3.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6.0 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；再加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；后加入4%氢氧化钠溶液4 mL，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，在500 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，见图1.求得回归方程为y=10.790 0x-0.000 5，相对标准偏差R2= 0.999 9.
图1 芦丁标准曲线
2.4 沙棘叶总黄酮提取
称取沙棘叶粉1.00 g，共3份，置于三角瓶中，分别加入60%乙醇溶液30 mL，超声30 min，静置过滤，收集滤液于100 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度。精密量取25 mL于50 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，得供试品溶液。
2.5 总黄酮含量的测定
精密量取供试品溶液0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，加30%乙醇至6 mL；加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；再加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；之后加4%氢氧化钠溶液4 mL，并用30%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min.同时，取供试品溶液0.5 mL于25 mL容量瓶中，加30%乙醇定容，作为空白溶液。用紫外分光光度计于波长500 nm处测定样品吸光度，按标准曲线计算样品中总黄酮含量。
3 结果与分析
3.1 超声功率对总黄酮提取率的影响
称取1.00 g沙棘叶粉15份(同一条件3次重复，结果取平均值)，1∶30的料液比，分别在100 W，80 W，60 W，40 W，20 W功率条件下，室温超声提取30 min，结果见图2.
图2 超声功率对总黄酮提取率的影响
超声波可以加速有效成分的释放与溶出，提高有效成分的提取率。由图2可知，随着超声功率的增高总黄酮提取率增大，当功率达到80 W时总黄酮提取率最高，功率达100 W时提取率不变。因此，从节约能耗考虑，适宜功率为80 W.
3.2 超声温度对总黄酮提取率的影响
称取1.00 g沙棘叶粉15份(同一条件3次重复，结果取平均值)，1∶30的料液比，功率80 W，分别在30 ℃(室温)，40 ℃，50 ℃，55 ℃，60 ℃温度条件下超声30 min，结果见第3页图3.
由图3可知，温度对沙棘叶总黄酮提取率有一定的影响，随着水温的升高提取率先增后减。当水温由室温升至40 ℃时，总黄酮提取率升高。当温度超过40 ℃，总黄酮提取率有所降低，可能是强烈的热效应会破坏沙棘叶中黄酮类化合物的缘故。温度超过50 ℃之后，提取率变化比较平缓。故最佳提取温度为40 ℃.
图3 超声温度对总黄酮提取率的影响
3.3 超声时间对黄酮提取率的影响
称取1.00 g沙棘叶粉15份(同一条件3次重复，结果取平均值)，1∶30的料液比，功率80 W，室温下分别超声提取5 min，10 min，15 min，20 min，30 min，结果见图4.
图4 超声时间对总黄酮提取率的影响
由图4可知，超声时间对沙棘叶总黄酮的提取率影响较大，随着超声时间的延长总黄酮提取率先增加后持平。超声时间20 min内总黄酮提取率增加比较明显，呈上升趋势。超过20 min后提取率无变化，说明超声20 min黄酮全部溶出。因此，浸提时间宜选择20 min.
3.4 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响
称取1.00 g沙棘叶粉15份(同一条件3个重复，结果取平均值)，分别加入40%，50%，60%，70%，80%乙醇水溶液30 mL，功率80 W，在室温下超声提取30 min，结果见图5.
图5 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响
由图5可知，当乙醇浓度由40%增加到60%时，总黄酮提取率缓慢增加，大于60%后提取率极速下降。原因是乙醇浓度过低时不能完全溶解出黄酮类化合物，但当浓度过大时，又会阻碍黄酮类化合物的溶出。因此，选择 60% 乙醇溶液为宜。
3.5 料液比对黄酮提取率的影响
称取 1.00 g 沙棘叶粉 15 份(同一条件 3 个重复，结果取平均值)，分别加入 10 mL，15 mL，20 mL，25 mL，30 mL 的 60% 乙醇水溶液，在功率 80 W，室温条件下超声提取 30 min，结果见图 6.
图6 料液比对总黄酮提取率的影响
由图6可以看出，料液比对总黄酮提取率有一定的影响，当料液比升高时总黄酮提取率也会升高，但当料液比达到 1∶20后总黄酮提取率变化不大。原因是料液比较低时不易充分稀释溶解出沙棘叶中的总黄酮，但当溶剂大于 1∶20 之后，会将杂质溶出。因此，选择 1∶20 料液比较为合适。
3.6 正交试验
根据上述单因素试验的结果，全面考虑提取工艺条件对沙棘叶总黄酮提取率的相互影响，进行4因素3水平的正交试验，以乙醇体积分数、超声温度、超声时间、料液比为研究因素，以沙棘叶总黄酮提取率来确定超声提取总黄酮的最佳工艺条件，因素水平设计见第4页表1.根据正交试验表操作，试验结果见第4页表2.
表1 正交试验水平设计
表2 L9(34)正交试验记录及结果
由表1和表2可以看出，各因素对沙棘叶总黄酮提取率影响的大小顺序依次为料液比(A)﹥超声时间(C)﹥超声温度(D)﹥乙醇体积分数(B)。正交试验最优水平为：A2B2C3D2，即料液比1∶20，乙醇体积分数60%，超声时间20 min，超声温度40 ℃.
3.7 工艺条件验证及结果
最佳工艺条件不在正交试验中，为了确定优化条件的精密度与可靠性，进行验证试验。按照得出的最佳工艺条件，对沙棘叶中总黄酮进行了 3 次平行提取试验，计算黄酮得率，结果如表 3 所示。
由表3可知，3次平均得率为5.97%，与正交试验中处理 5的结果一致，说明室温下也能得到较高的黄酮提取率。可能是由于超声波振动产生的热能，使水温升高，加速了黄酮溶出。为节约能耗也可常温下超声提取。RSD值为0.97%，说明该结果可靠。
表3 沙棘叶黄酮测定结果
4 结论
试验采用超声波法提取沙棘叶总黄酮，以乙醇水溶液为提取剂，通过单因素与正交试验考察了超声功率、料液比、超声时间、超声温度、乙醇体积分数等因素对沙棘叶中总黄酮提取率的影响。优化后的最佳工艺条件为料液比 1∶20，乙醇体积分数 60%，超声时间 20 min，超声温度 40 ℃. 该方法不仅可保证沙棘叶总黄酮的生物活性，且具有操作简单、提取速度快、耗能低、提取率高等优点，对实现工业化生产沙棘叶黄酮具有一定的参考价值。
