超声处理对大豆亲脂蛋白结构及溶解性的影响

李 杨 王迪琼 齐宝坤 钟明明 徐清清 谢凤英

(东北农业大学食品学院， 哈尔滨 150030)

0 引言

长期以来，大豆分离蛋白(Isolated soybean protein, SPI)被认为由两种储存蛋白组成，即大豆球蛋白(11S)和β-伴大豆球蛋白(7S)，且SPI的功能特性取决于这两种蛋白质之间的相互作用[1]。大豆储存蛋白组分中含有一种占SPI 30%左右的亲脂性蛋白质(Lipophilic protein, LP)，有望作为天然乳化剂在食品工业中得到广泛应用[2]。因此，SPI的其他功能特性应基于这3种蛋白质组分的性质重新考虑。文献[3]研究发现，SPI较低的溶解度可以通过LP的存在来解释。现有文献对11S和7S的相关研究较多，对LP的相关研究较少。LP的主要成分是油体蛋白-磷脂，它是油体的原始成分，且具有较强的亲油性[2]，可作为乳化剂提高乳液的稳定性。由于LP水溶性差，降低了其乳化效果，因此提高LP溶解性对其应用至关重要。

文献[4]研究发现，将LP超声处理5 min可使其在磷酸缓冲液中均匀分散，但未详细论述不同超声条件对LP结构及溶解性的影响。目前，国内外对蛋白改性的方法主要有物理法、化学法和酶法等，超声波改性作为一种有效的物理改性手段被广泛使用。如文献[5]采用超声处理显著提高了花生分离蛋白的表面疏水性，进而改善其乳化性；文献[6]采用超声处理使大豆分离蛋白形成可溶性聚集体，进而提高其溶解度；文献[7]证明，采用超声处理可减小液滴尺寸，进而提高小麦蛋白和大豆分离蛋白的乳化性。故超声可作为提高LP溶解性及结构特性的手段，而目前超声条件处理对LP的影响研究尚属空白。

本文探究超声处理对LP的结构及溶解性的影响，在超声功率(120～480 W)和超声时间(10、20 min)处理条件下，研究超声对LP的物化作用，并确定最佳的超声条件，在保留LP必要结构特性的基础上，提高其溶解度及其他功能特性，以期为LP的进一步应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆，东北农业大学大豆研究所；氢氧化钠、氯化钠，天津市光复精细化工研究所；硫酸，北京新光化工试剂厂；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，天津市东丽区天大化学试剂厂；8-苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)，美国Sigma公司；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204型分析天平，梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司；CL-2 型恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；6 L落地式冻干机，上海汇分电子科技有限公司；LGR20-W型台式高速冷冻离心机，北京京立离心机有限公司；Delta320 型pH计，梅特勒-托利多仪器公司；FJ200-SH型数显高速分散均质机，上海标本模型厂；MAGNA-IR560型傅里叶变换红外光谱仪，美国NICOLET公司；F-4500型荧光分光光度计，日本HITACHI公司；Q1000型差示扫描量热仪，美国TA仪器；UV-5100 型高性能紫外可见分光光度计，上海奥析科学仪器；Phomo型酶标仪，郑州安图实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1大豆亲脂蛋白提取

大豆LP组分的分离由文献[2]的方法经修改后使用。将大豆磨粉，过60目筛后使用正己烷进行脱脂，并在70℃干热处理2 h，此时氮溶解指数降至75%，可有效防止LP与11S共沉淀。干热处理后的脱脂豆粉按料液比8 g/mL加入到蒸馏水中，用NaOH调节pH值至8.0。在20℃下搅拌1 h后3 000g离心10 min。分离上清液并加入10 mmol/L Na2SO3,然后用H2SO4调节pH值至5.8，随后3 000g离心10 min分离上清液，将上清液用H2SO4调节pH值至5.0，并在55℃下处理15 min。然后加入50 mmol/L NaCl并用NaOH调节pH值至5.5，3 000g离心10 min，沉淀即为LP组分，冻干备用。

1.3.2超声处理

将4.8 g LP溶解在240 mL的磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L, pH值7.0)，在室温(20℃)下搅拌2 h，制得质量浓度为20 mg/mL的大豆亲脂蛋白溶液，将超声处理器的钛探头(直径0.636 cm)插入液面，进行超声处理，本试验选择在20 Hz下，超声功率为0、120、240、360、480 W，超声时间为10、20 min，样品编号见表1，每超声处理4 s，间隔2 s。

表1 不同超声处理样品编号

1.3.3十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

根据文献[8]的方法进行SDS-PAGE电泳试验。分别配置12%的分离胶与5%的浓缩胶，将5%的2-巯基乙醇(2-ME)加入到样品缓冲液中。将样品和缓冲液的混合物在沸水中加热5 min，用于电泳运行的缓冲液是0.025 mol/L Tris-HCl，0.192 mol/L甘氨酸和0.1%SDS，上样量为10 μL，之后凝胶采用0.1%考马斯亮蓝(R-250)染色液(含45%甲醇和10%冰乙酸)染色30 min，并用脱色溶液洗涤脱色后分析。

1.3.4傅里叶红外光谱(FITR)

将超声处理后的大豆分离蛋白溶液进行冻干，冻干后的样品置于干燥器中用P2O5充分干燥，取样品1.5 mg，与200 mg溴化钾研磨混匀后压片进行红外光谱测定。在试验过程中，为了减少蒸汽的干扰，用干燥的N2持续注入测量室。测定时波数范围为4000～400 cm-1，扫描次数为64次，分辨率4 cm-1，得到的红外吸收曲线采用Peak fitting软件和高斯曲线拟合，分析大豆亲脂蛋白不同超声功率下二级结构含量的变化[9]。

1.3.5内源荧光光谱

将 20 mg/mL大豆蛋白溶液用pH值7.0的磷酸盐缓冲溶液稀释到0.1 mg/mL，取一份稀释液3 mL置于石英比色皿中扫描荧光图谱。扫描条件为：记录发射波长200～500 nm，激发波长设置为290 nm，增长间隔为10 nm。

1.3.6外源荧光强度

参照文献[10]的方法稍作修改，采用ANS作为荧光探针测定蛋白质的外源荧光强度。分别称取0.025 g不同品种蛋白样品溶于50 mL 磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH值7.0)中，在室温条件下搅拌1.0 h后离心(10 000g，30 min)，取上清液用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法测定蛋白质量浓度，并用磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH值7.0)依次稀释蛋白，使其质量浓度在0.005～0.1 mg/mL之间，将所得梯度的上清液溶液与8.0 mmol/L ANS以体积比100∶1混合，静置3 min后测其荧光强度。激发波长390 nm，发射波长4 970 nm，夹缝为5 nm。以荧光强度对蛋白质质量浓度制图，初始段斜率即为蛋白质分子的外源荧光强度。

1.3.7差示扫描量热法(DSC)

参照文献[11]的方法，用铝制坩埚称取3.0 mg(干基)样品，按料液比6 mL/g加入去离子水，压盖密封后，置于室温平衡后测定，差示扫描量热法(DSC)测量使用Q1000型差示扫描量热计以10℃/min的扫描速率在30～140℃范围内进行。使用热分析系统(TA-60WS)软件测定变性峰的温度。

1.3.8溶解性

参照文献[12]的方法稍作修改测定大豆分离蛋白溶解性，用质量浓度约为10 mg/mL的蛋白质溶液(pH值8.0)，搅拌1 h使样品溶解，静置2 min后，将上清液倒入离心管中离心15 min(10 000g)。取上清液2 μL稀释10倍，采用BCA法测定蛋白质质量浓度。以牛清蛋白为标准物，蛋白质溶解度为上清液中蛋白的质量浓度占样品中总的蛋白质量浓度的百分比。

1.4 数据处理

本试验数据均为3个平行样的平均值，结果采用SPSS 22.0分析软件和Origin 8.0软件进行处理，采用ANOVA对数据进行差异显著性分析(P<0.05)。

2 结果和讨论

2.1 SDS-PAGE凝胶电泳分析

图1 不同超声处理下LP的SDS-PAGE图谱

不同超声条件下LP的SDS-PAGE图谱显示如图1(图中M表示标准牛血清蛋白)所示，LP中包含7S和11S的亚基以及脂氧合酶、膜蛋白，34 ku蛋白存在于蛋白质的储存液泡中，24、18、17 ku为来自油体蛋白[2-3,13]，LP中脂类质量分数为(7.48±0.049)%，较11S(2.36±0.026)%与7S(1.45±0.047)%高很多[3]，其脂质组分经薄层色谱分析显示主要为磷脂，如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇[2]，而由于含有较高含量磷脂，因此膜蛋白对考马斯亮蓝具有较低的染色敏感性[3]，其电泳图上条带强度较7S、11S的亚基弱。而本研究旨在探明超声处理对LP结构特性的影响，如图1所示，与未超声处理的LP相比，超声处理后的LP亚基含量出现不同程度的改变，当超声时间为10 min，超声功率在120～360 W时，分子质量48 ku以上的亚基含量都明显降低，这是因为超声产生的空化效应破坏了大亚基结构；当超声功率增加到480 W时，亚基含量整体降低，48 ku以上亚基条带几乎消失，这说明高强度超声功率会引发LP亚基结构破碎和解离。结果表明，适当条件的超声处理可有效保留LP亚基结构，并在此基础上改善LP的物化性质。图谱显示超声后亚基种类并没有太大变化，表明超声处理不会对LP的一级结构产生太大影响，与文献[14-15]研究结果一致。

2.2 FITR分析

超声处理后，LP的FITR光谱图如图2所示，波数从1 640 cm-1到1 650 cm-1变化时透光率增加，超声处理的空化效应会导致β-转角的展开，而无规则卷曲增加，使用傅里叶自反卷积(FSD)拟合和二阶导数分析来实现最大频带变窄，降低信噪比并鉴定LP中存在的不同类型二级结构，之后采用杨氏方程计算LP的二级结构，结果如表2所示，超声处理10 min时，随超声功率的增加α-螺旋减少，β-折叠先增加后减少，无规则卷曲增加，与超声处理牛血清蛋白和乳清蛋白的结果一致[16-17]，而超声处理20 min时，随超声功率的增加α-螺旋先增加后减少，β-折叠先增加后减少，再略有增加。此结果可能是由于超声处理的空化效应使气泡振荡并破裂，从而产生坍塌压力、湍流和剪切应力，影响了氨基酸的局部序列以及分子之间的相互作用并使β-转角展开，无规则卷曲减少[18]。

图2 不同超声处理条件下LP的FITR光谱图

表2 不同超声处理下LP的二级结构相对含量

注：同列不同字母表示有显著性差异(P<0.05)。

2.3 内源荧光光谱分析

大豆蛋白所表现出的内源荧光强度主要是因其含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)[19]，激发波长为280 nm，主要依靠Trp和Tyr发射荧光[20]，Trp荧光强度较强是由于Tyr与Trp之间发生了能量转移，而荧光的变化可反映色氨酸微环境的变化[21]，因此色氨酸的荧光峰可近似看作大豆蛋白的荧光峰，从而反映大豆蛋白的三级结构。由图3可知，超声处理后，LP的内源荧光强度均发生不同程度的增加，在超声处理时间为10 min时，内源荧光强度随着超声功率的增加先增大后减小，并且最大波长(λmax)发生不同程度的红移，可能由于超声处理期间，LP分子通过水解解折叠，破坏其疏水作用[22]，Trp的微环境由疏水变为亲水，一般情况下荧光波长会随着溶剂极性的增大而红移，内源荧光强度也会有所增加，因为在极性溶剂中π→π*跃迁所需的能差减小，跃迁概率增加。而超声强度过大时会导致暴露于溶剂的生色团数量增加，从而导致内源荧光强度降低。

图3 不同超声处理下LP的内源荧光光谱

2.4 外源荧光强度分析

图4 不同超声处理下LP的外源荧光强度

外源荧光强度反映蛋白质分子表面上存在的疏水基团数量，文献[19]研究认为疏水相互作用对蛋白质构象、功能和稳定性有重要影响。如图4(图中不同小写字母表示差异显著)所示，超声10 min、功率为360 W以及超声20 min、功率为240 W时外源荧光强度较强，并且功率较低时呈现递增趋势。超声波处理会破坏蛋白质的非共价键引起蛋白质分子一定程度的展开，以及最初在蛋白质分子内的疏水基团暴露于外部环境，因此增加了疏水基团的数量[23]，而超声强度较大时，外源荧光强度下降，超声强度极强时可能导致LP聚集，疏水区封闭[24]，而持续增加超声功率及时间，可能由于超声波诱导蛋白质彻底变性，疏水残基暴露，疏水性增加。本研究中，由图4、5可看出，蛋白质的外源荧光强度越大溶解度越大，文献[23-24]也得出此结果。

2.5 差示扫描量热法

DSC的峰值温度T2反映蛋白质结构的稳定性，焓变ΔH是引起蛋白质变性所需的能量，较高的焓值表示更有序稳定的蛋白质结构[25]，通过检测不同超声条件下LP热变性温度及其焓变，分析LP的热稳定性，超声处理后，LP的T2有所升高，360 W和240 W时的T2最高，提高了6～7℃，如表3所示。文献[26-29]认为，由于超声处理时产生的剪切力，导致分子间二硫化物和非共价键被破坏，并且游离巯基失活，有效减少了超声过程中蛋白质的再聚集，当超声功率过大时，LP的变性温度下降，可以推测此时蛋白质分子结构被大量破坏。而LP经超声处理后，焓值明显下降，这可能与LP分子的展开有关，之后焓值随超声功率的增加而增加，可能与分子间疏水键部分重组有关[30]。因此，适度超声可以提高LP的变性温度，并且提高其结构稳定性。

图5 不同超声处理下LP的溶解性

表3 不同超声处理下LP的DSC

2.6 溶解性

溶解性会促成或影响大多数蛋白质所表现出的功能性质，而LP由于含大量磷脂，相比7S、11S，其溶解性较差，图5(图中不同小写字母表示差异显著)显示，超声处理后，LP的溶解性得到了显著改善，样品D和G的溶解性最好，溶解度为41.1%和43.0%，提高了20个百分点左右。在超声处理过程中发生的空化效应会产生大量的空化气泡，这会增加周围塌陷气泡区域的局部温度和压力[31]，导致蛋白质的去折叠，构象改变，进而使其内部亲水性氨基酸残基暴露[32]，并且由于超声处理期间促使蛋白中的不溶性沉淀物形成可溶性聚集体[33]，因此溶解性得到显著提升。而与肽键的水解关系不大，因为超声处理后LP的SDS-PAGE图谱并无太大变化，此结果与文献[23]的研究一致，由图中样品E、F、H可知，持续增加超声功率及时间会导致再次溶解性降低，可能是由于不溶性聚集体的形成[34]。溶解性会影响大多数蛋白质的功能性质，因此有必要确定最佳的超声功率及时间，为改善LP的理化性质及功能性质提供最佳的预处理条件。经试验确定最佳超声条件为：在360 W超声功率下处理10 min。

3 结束语

超声处理对LP的结构及溶解性具有相当大的影响，超声处理后在电泳图中分子量未发现明显变化，亚基含量有所改变，经红外、荧光光谱分析后发现，其二级、三级结构发生明显变化。超声处理后LP分子间的非共价键减少，分子解折叠，减少了蛋白质分子的再聚集，提高了其变性温度及结构稳定性，而结构的改变导致功能性质改变。本研究中，超声功率为360 W时处理10 min和超声功率为240 W时处理20 min，对LP的溶解性及疏水作用的改善效果最佳，而继续增加超声功率及超声时间，则会对LP的性能产生负面影响。这是由于过剩的能量导致蛋白质过度解折叠，大量疏水残基暴露，重新形成了不溶性聚集体。经试验确定最佳超声条件为：在360 W超声功率下处理10 min。