基于能量代谢物质探讨胃溃疡大鼠足三里穴的敏化反应

2020-03-08朱小香萨喆燕周丽莉叶笑然杨广印林静瑜许金森

山西中医药大学学报 2020年6期

朱小香，萨喆燕，万隆，周丽莉，叶笑然，杨广印，林静瑜，许金森

（福建省中医药科学院福建省经络感传重点实验室，福建福州350003）

足三里穴是胃之下合穴、胃经之合穴，为治疗胃病的首选穴，《四总穴歌》“肚腹三里留”则是对其主治作用的经典概括。足三里与胃是经穴-脏腑相关理论的代表之一，然而，课题组在以往的研究中，通过观察伊文思蓝（evans blue，EB）渗出的方式确定胃溃疡大鼠的体表敏化穴位，发现EB渗出点多出现在督脉背段及膀胱经第一侧线，足三里穴未发现EB渗出点［1］。这与程斌等［2-3］的研究基本一致。但是足三里与胃疾病的相关性是勿庸置疑的，这不仅在古代经典文献中有不少记载，在现代临床中也普通应用。漆学智等［4-5］临床研究也发现，足三里在胃肠道疾病中出现穴位压痛敏化现象。那么，胃溃疡时，足三里穴是否发生了敏化？是否以其他方式来表现其敏化？三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）及其代谢产物二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）是体内物质代谢和能量代谢的重要中间产物。研究表明，ATP等腺苷酸类物质参与针灸对多种疾病的良性调节作用［6］。因此，本研究以ATP、ADP和AMP为观察指标，探讨胃溃疡大鼠胃组织和足三里穴区组织的能量代谢情况，为探讨穴位敏化的表现形式和物质基础提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物健康SD大鼠32只，雄性，清洁级，体质量（250±25）g，购自福建医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（闽）2012-0001。购入后于福建省中医药科学院实验动物中心清洁级实验室中适应性喂养1周（恒温、12 h光照/d）。实验动物条件符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》要求。本实验过程中对动物的处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》要求。

1.1.2 仪器和试剂宠物剃毛器（广州科德士电子公司）；全波长扫描式多功能酶标仪（美国Thermo公司）；吲哚美辛（上海罗恩试剂公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；ATP、ADP和AMP ELISA试剂盒（均购自上海酶联生物科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模 32只大鼠随机分为正常对照组（正常组）和胃溃疡模型组（模型组），每组16只。胃溃疡大鼠模型制备采用吲哚美辛腹腔注射法。即大鼠禁食不禁水15 h，按15 mg/kg剂量腹腔注射吲哚美辛（4 mg/mL，溶于5%NaHCO2溶液中），6 h后制成大鼠胃溃疡模型。模型成功的标准：大鼠安静，萎靡不振，拉柏油样便；形态学上可见胃黏膜有出血点和溃疡灶。

1.2.2 胃溃疡指数观察每组各取6只大鼠用于胃溃疡指数（UI）计算。10%水合氯醛麻醉大鼠后剖腹取胃，将幽门部和贲门部用线结扎，向胃内注入4%多聚甲醛2 mL，在两结扎线外摘下全胃，置于4%多聚甲醛中固定30 min。然后沿胃大弯剪开并用水清洗胃内容物，参照GUTH′S法计算UI：全胃各病灶长度之和为损伤指数。损伤≤1 mm（包括糜烂点）为1分，1 mm＜损伤≤2 mm为2分，2 mm＜损伤≤3 mm为3分，3 mm＜损伤≤4 mm为4分，依此类推。损伤宽度＞2 mm者UI加倍。

1.2.3 取材在腹腔注射吲哚美辛造模后的第7天，10%水合氯醛麻醉大鼠后用宠物剃毛器剃掉大鼠足三里穴毛发，取足三里穴皮肤及皮下肌肉组织0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，然后剖腹取胃组织（胃窦和胃体部），置于EP管中，保存于-80℃冰箱待测。

1.2.4 ATP、ADP和AMP浓度及能量负荷（EC）的测定

1.2.4.1 总蛋白浓度的测定对各标本匀浆后离心取上清液，采用双辛丁酸法（bicinchoninic acid，BCA）法进行总蛋白浓度的测定，按BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明书进行测定。

1.2.4.2 ATP、ADP和AMP的测定分别按大鼠ATP、ADP和AMPELISA试剂盒的使用说明书进行测定。

1.2.4.3 ATP、ADP和AMP的最终浓度（单位为μmol/μg）计算 ATP、ADP和AMP的检测浓度/BCA总蛋白浓度。

1.2.4.4 EC计算 EC=（ATP+0.5×ADP）/（ATP+ADP+AMP）。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组大鼠UI的比较

正常组3只大鼠胃黏膜结构完整，未见溃疡，3只大鼠胃组织可见几个点状小溃疡；模型组大鼠胃组织溃疡明显，多呈线状。模型组大鼠胃黏膜UI值较正常组明显升高（P＜0.01），差异有统计学意义，提示大鼠胃溃疡模型复制成功。正常组大鼠出现溃疡可能与实验环境应激有关，体现了设定正常组的意义。结果见表1。

表1两组大鼠胃溃疡指数比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01

组别 n UI正常组 6 1.33±1.75模型组 6 58.33±34.741）t值 -4.014 P值 0.002

2.2 两组大鼠胃组织能量代谢物质含量及能量负荷的比较

与正常组比较，胃溃疡模型组大鼠胃组织ATP、ADP含量显著降低（P＜0.001，P＜0.05），AMP含量显著升高（P＜0.001），能量负荷显著降低（P＜0.001）。结果见表2。

表2 两组大鼠胃组织能量代谢物质及能量负荷比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.001

2.3 两组大鼠足三里穴区组织能量代谢物质含量及能量负荷的比较

与正常组比较，胃溃疡模型组大鼠足三里穴区组织ATP、ADP含量显著降低（P＜0.001，P＜0.01），AMP含量显著升高（P＜0.01），能量负荷显著降低（P＜0.01）。结果见表3。

表3 两组大鼠足三里穴区组织能量代谢物质及能量负荷比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01，2）P＜0.001

3 讨论

穴位是人体脏腑经络气血输注出入的特殊部位，是经络-脏腑相关中的一个重要环节。古代文献和现代临床均表明，穴位对于疾病不仅具有治疗作用，而且具有诊断作用。《灵枢·背腧》记载：“欲得而验之，按其处，应在中而痛解，乃其腧也……”此乃描述了古人以压痛点进行揣穴并以此作为治疗部位进行针灸的一种方法，也说明了穴位敏化是中医诊断和针灸治疗作用的基础。现代针灸临床中也多有通过诊察穴位局部感觉等变化来诊断和治疗疾病的报道［7-8］。随着穴位敏化研究的不断深入，朱兵在《系统针灸学》中提出的穴位本态观点得到了广泛认同，即穴位是机体在病理状态下能与相应靶器官/组织发生交互作用的体表位域［9］。穴位的功能活动是一个动态变化的过程，会随机体的生理病理变化而产生对应的“静息态”和“激活态”，从而存在“开/合”的动态变化。穴位由“静息态”向“激活态”的转化过程被称为穴位的敏化，穴位敏化过程是针灸发挥治疗作用的基础［10］。

既往研究表明，穴位敏化的表现形式主要有痛敏化、热敏化、光敏化、电敏化、声敏化、压力敏化、化学敏化、形态敏化和微循环敏化等［11-12］。其中痛敏和热敏的研究较为多见，化学敏则作为一个较新的概念出现于近些年的文献中。化学敏是指穴位局部组织细胞化学成分的改变，如敏化状态下释放神经肽、致敏物质等［11］。目前研究较多的穴位敏化相关物质有P物质、降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、组胺等。罗廖君等［13］在对足三里穴位敏化相关文献的研究中，将借助针灸等干预后采用生物化学手段进行的检测均计入化学敏范畴，归纳足三里化学敏研究主要指标包括强啡肽、β-内啡肽、P物质、血浆5-HT含量、中缝核5-HT表达等，检测指标主要依据研究病种不同而存在变化。本研究基于能量代谢物质ATP、ADP和AMP探讨胃溃疡大鼠足三里穴的敏化反应，属于化学敏的范畴。

ATP作为细胞的主要供能物质参与体内的许多代谢反应。当ATP作为能量物质被消耗时，则随着能量的释放逐级转化为ADP、AMP。当细胞内能量富余时，则会使ADP磷酸化转换成ATP来存储多余的能量。组织内ATP、ADP和AMP可根据机体的代谢状况相互转化，从而产生能量负荷比率的变化。因此，通过组织中ATP、ADP和AMP的含量可推测机体或局部组织的能量代谢情况。研究发现，心肌缺血、脑缺血、膀胱机能障碍等均可出现相应脏腑ATP、ADP和AMP的代谢变化，针灸对其具有良性调节作用［14-16］。然而研究多集中于观察脏腑中的ATP等能量代谢变化，对所干预穴位局部的相关观察则较为少见。本研究发现，胃溃疡大鼠的胃组织和足三里穴区组织ATP、ADP含量和能量负荷均显著降低，AMP均显著升高。可见，当发生胃溃疡时，不仅胃组织ATP的能量消耗增加，足三里穴区也随之发生ATP能量消耗的增加，这可以说是中医“有诸内必形诸外”在生物化学层面的一个体现，说明了足三里是与胃腑经络之气相通并随之活动变化的反应点之一。这也在一定程度上为足三里与胃的相关性提供了实验依据。我们在前期运用EB渗出观察胃溃疡相关的穴位敏化研究中，EB渗出点多在督脉背段及膀胱经第一侧线，并未发现足三里穴区有EB渗出点，但本研究进一步实验发现，胃溃疡状态下，足三里穴区的能量代谢物质ATP、ADP和AMP含量均发生明显变化，这可能是胃溃疡疾病在体表穴位的一种化学敏化反应，说明同一疾病不仅具有多部位的穴位敏化，而且穴位敏化形式也具有多样性。