三唑磷对斑马鱼肝脏氧化损伤作用研究
2020-03-07李方敏姚灿灿丁存宝
李方敏，姚灿灿，丁存宝
（华北理工大学生命科学学院，河北唐山063000）
三唑磷是一种广谱性有机磷杀虫剂，主要被用来防治蝇类幼虫、地下害虫等，进入水体后会毒害水生生物，并对水体环境造成长期的不良影响[1]。三唑磷在进入生物体后，会刺激生物体内活性氧自由基的产生，使得活性氧自由基的数量迅速增加，进而产生氧化应激反应。生物体内抗氧化体系的变化，对检测、防治水污染具有重要意义[2]。不同的三唑磷浓度会对斑马鱼体内的超氧化物歧化酶[3]、过氧化氢酶、乙酰胆碱酯酶等与活性氧自由基[4]清除相关的酶系统造成一定的影响。因此，本研究对这种影响进行定量分析，为斑马鱼作为污染检测指示生物提供理论依据[5]。
1 材料和方法
1.1 试验材料
三唑磷试剂购买自北京鼎瑞（集团）化工有限公司，配制成浓度为0.05 μL/L、0.50 μL/L、1.20 μL/L的溶液。
将购买的斑马鱼等量分为4组，每组50条，分别喂养在3种三唑磷浓度的小鱼缸中，持续喂养4周。每周从各鱼缸中取出10条斑马鱼进行后续实验。
1.2 匀浆制备
将斑马鱼放置在冰上，以达到迅速致死的效果；使用解剖镜对斑马鱼进行解剖，将肝脏取出，并准确称取肝脏的质量；加入生理盐水，在冰水浴条件下机械搅匀；在 2 500 r/min 条件下离心 10 min，取上清液，用生理盐水进行10倍稀释，并进行后续测定。
1.3 生理生化指标测定
1.3.1 总蛋白含量采用测定（BCA法）
碱性条件下，待测样品中的蛋白质将Cu2+还原为Cu+，Cu+和BCA试剂反应，产生一种紫色络合物，可于562 nm处测定吸光度值，并计算出蛋白质的浓度。
1.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）的测定（羟胺法）
黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生的·O2可氧化羟胺形成亚硝酸盐，与显色剂作用呈紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。被测样品中含SOD，会抑制·O2的产生，亚硝酸盐的浓度因此降低。
1.3.3 过氧化氢酶（CAT）的测定
过氧化氢酶会分解过氧化氢，三唑磷的刺激会降低过氧化氢酶的活性，使得过氧化氢的含量增加，通过检测过氧化氢的含量来测定过氧化氢酶。
1.3.4 脂质过氧化（MDA）的测定（TBA法）
脂质过氧化形成的丙二醛与硫代巴比妥酸进行缩合反应，生成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰，可通过测定红色产物含量计算脂质过氧化。
1.3.5 乙酰胆碱酯酶（AChE）的测定
AChE使乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，剩余乙酰胆碱与羟胺作用生成乙酰羟胺，再与铁离子在酸性溶液中形成棕色复合物，可通过测定棕色复合物含量计算乙酰胆碱酯酶。
2 结果与分析
2.1 斑马鱼活力及形态变化
斑马鱼体长 2～3 cm，体重约 0.3 g。前两周，斑马鱼活力正常，进食状况良好。随着时间的推移，三唑磷浓度为1.2 μL/L的浴缸中，斑马鱼开始出现进食量减少、游动活力减弱的现象。实验期间，3组斑马鱼均未出现死亡情况。
2.2 三唑磷对总蛋白含量的影响
分析图1可知，三唑磷处理1周时，低浓度的三唑磷能够适当促进总蛋白含量的提升，但随三唑磷浓度的继续升高，总蛋白含量会低于对照组；处理2、3、4周后，3个三唑磷处理组相较于空白对照组，总蛋白含量均呈现下降趋势，但0.5 μL/L浓度的三唑磷对总蛋白含量影响最小。
图1 三唑磷对斑马鱼总蛋白含量的影响
2.3 三唑磷对超氧化物歧化酶（SOD）的影响
分析图2可知，随着三唑磷农药浓度的升高，SOD比活力呈现出先升高后下降的趋势。三唑磷浓度为0.5 μL/L时，SOD的比活力最高；三唑磷浓度为1.2 μL/L时，SOD比活力降低。
图2 三唑磷对斑马鱼SOD比活力的影响
2.4 三唑磷对过氧化氢酶（CAT）的影响
分析图3可知，在前3周，随着三唑磷农药浓度的升高，CAT的比活力表现为先升高后降低。三唑磷农药浓度为0.05 μL/L时，比活力升高幅度最为明显，但是，随着处理时间的加长，升高幅度会逐渐下降。在处理一周之后，对照组的CAT比活力值异常偏低。在第四周的时候，CAT的比活力先下降，后又升高，与前三周的情况正好相反。
2.5 三唑磷对脂质过氧化（MDA）的影响
由图4可知，经过三唑磷处理之后，同对照组相比，丙二醛的含量迅速降低，且呈剂量依赖性。
图3 三唑磷对斑马鱼CAT比活力的影响
图4 三唑磷对斑马鱼MDA含量的影响
2.6 三唑磷对乙酰胆碱酯酶（AChE）的影响
分析图5可知，在处理一周之后，三唑磷浓度为0.05 μL/L和1.2 μL/L的AChE比活力明显下降，而三唑磷浓度为0.5 μL/L的AChE的比活力则升高。处理两周之后，AChE的比活力均下降，并且随着处理时间的加长，下降的幅度越来越大。
图5 三唑磷对斑马鱼AChE比活力的影响
3 讨论
超氧化物歧化酶的功能是清除活性氧自由基，能够将超氧自由基转换为氧气和过氧化物。将斑马鱼饲养在含有三唑磷农药的水中，斑马鱼的正常生长发育会受到影响，其体内的活性氧自由基数量会迅速、大量地增加[6]，与清除活性氧自由基相关的酶系统的活性将会被激发。随着刺激时间的加长，活性被激发得越彻底。但是，三唑磷浓度过高时，斑马鱼体内的酶系统会遭到破坏，超氧化物歧化酶可能会失活，比活力将会下降。
动物肝脏中CAT的含量很高，其主要功能是催化生物体内的过氧化氢发生反应，使其转化成分子氧和水[7]。随着三唑磷刺激时间的加长、农药浓度的升高，CAT的活性会被抑制，甚至失活。试验中，三唑磷浓度为1.2 μL/L时，CAT的比活力呈现上升趋势。
脂质过氧化的最终产物是丙二醛。生成丙二醛之后，细胞膜的通透性会被破坏，流动性会降低。生物体内的蛋白质等生物大分子还能与丙二醛发生反应，从而使其自身的结构和功能被改变，细胞正常的代谢功能会受到阻碍[8]。
乙酰胆碱酯酶[9]（AChE）在生物体内主要发挥解毒的功能，对三唑磷的存在有一定的指示作用。当乙酰胆碱酯酶的抑制率达到20%时，就能证明毒害作用的存在。当斑马鱼受到三唑磷的毒害作用时，乙酰胆碱酯酶的活性也会受到影响，会刺激具有解毒作用的AChE活性增强。随着处理时间的加长，以及三唑磷浓度的增高，对蛋白酶的活性抑制作用也越来越强，AChE的量会减少，活性也会受到抑制。
4 结论
由实验数据可知，随着三唑磷浓度的升高，斑马鱼体内的SOD、CAT比活力会呈现出先升高后下降的趋势；MDA的含量会呈现出明显的下降趋势。根据这一结果，可以将斑马鱼作为污染检测的指示生物。用待检测的水处理斑马鱼，检测斑马鱼体内SOD、CAT、MDA的变化，如果符合上述变化趋势，则说明水质可能被某种农药污染。
