新型NaGdF4纳米造影剂的制备及性能

孙天赐，刘建华，钱海生，何 涛

(1.合肥工业大学化学与化工学院，安徽合肥230009；2.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥230009)

磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，简称MRI)无辐射、安全性高、软组织分辨能力较强，已成为临床影像医学的重要手段[1]。MRI通常需要使用造影剂(Contrast-agent)进行高分辨的影像学诊断[2-3]。目前的T1类商用造影剂包括Gd-BOPTA(钆喷酸葡胺)[4]、Gd-DTPA-BMA(Omniscan)[5]和Gd-BOPTA(Multi Hance)[6]等。传统的Gd3+类鳌合物造影剂存在体内滞留时间短、弛豫率低、Gd3+易泄漏、毒性较高等缺陷[7-10]。为克服这些缺点，T1类钆基纳米磁共振造影剂近期引起了广泛的关注[11-13]，其优势包括化学稳定性好，Gd3+泄漏小，毒副作用低[14]，成像对比度高等[15]。此外，相关研究表明，尺寸小于20nm的纳米造影剂通常具有较低的细胞摄取水平，作为成像探针具有更长的体内滞留时间[16]。

我们前期报道了一种基于制备NaGdF4纳米T1造影剂的方法[17]。NaGdF4纳米颗粒经过亲水聚合物的表面修饰，可均匀分散于水中，稳定性较好，毒性较低，可作为高效MRI的T1造影剂。前期工作中，我们采用了固定分子量的线形PEG/PAA 共聚物进行纳米颗粒的表面修饰，主要考查其生物应用部分，尚未关注不同分子量的聚合物对纳米颗粒的修饰及相关水分散效果、形貌等的影响。

本工作中，我们着重于采用不同聚合比例的聚合物对NaGdF4纳米颗粒进行亲水性修饰，并考查其形貌和性能随聚合物的变化，从而掌握制备稳定NaGdF4纳米水分散液的相关信息。这些内容对未来制备稳定高效并进一步推广NaGdF4类纳米造影剂至关重要。我们通过可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)，首先合成了线型嵌段共聚物聚丙烯酸-聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(P(AA-b-OEGMA))；接着采用配体交换法对NaGdF4纳米颗粒进行亲水性修饰。我们发现，采用不同分子量的P(AA-b-OEGMA)进行修饰，会得到不同形貌的P(AA-b-OEGMA)-NaGdF4纳米颗粒水分散液(PAO-NaGdF4-NPs，PAO-NaGdF4-Cluster)：即单分散和纳米聚集体形貌。我们对所得PAO-NaGdF4的尺寸、形貌及性能进行了表征。结果表明，两种PAO-NaGdF4纳米均具有良好的水分散性和稳定性，Gd3+的泄漏率均很低。体外M R实验显示二者弛豫率是商用Gd-BOPTA 复合物的1.5～2倍，具有良好的临床转化前景。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CT A)、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)，分析纯，Sigma-Aldrich公司；丙烯酸(AA)、偶氮二异丁腈(A IB N)，分析纯，阿拉丁；1,4-二氧六环、环己烷、丙酮、四氢呋喃(T H F)，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；NaGdF4纳米颗粒按前期报道自制[17]。

1.2 P(AA-b-OEGMA)的合成

采用可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)方法进行，分两步聚合：

在反应管中，加入链转移剂CT A(27.9mg，0.1 mmol)，引发剂A IB N(3.28mg，0.02 mmol)，一定量的单体OEGMA，用5 mL 1,4-二氧六环溶解。密封条件下，通过冷冻解冻泵循环法除去反应体系中的氧气。将反应管置于70℃油浴下，通入氮气，磁力搅拌反应16h。反应结束后，产物在环己烷中沉淀，真空干燥，得到聚合产物POEGMA，通过控制OEGMA 的投入量控制POEGMA 的分子量。反应式如图1所示。

图1 POEGMA 的合成示意图

图2 P(AA-b-OEGMA)的合成示意图

在反应管中，上述产物POEGMA、引发剂A IB N(3.28mg，0.02mmol)、不同量的单体AA，溶解于8mL 1,4-二氧六环。密闭条件下，氧气通过冷冻解冻泵循环法除去，随后将反应管通入氮气，70℃油浴加热，磁力搅拌反应16h。反应结束后，产物用环己烷沉淀，真空干燥，得到聚合产物P(AA-b-OEGMA)，通过控制AA 的投入量控制P(AA-b-OEGMA)的分子量。反应式如图2所示。

1.3 水分散P(AA-b-OEGMA)-NaGdF4(PAO-NaGdF4)的合成

采用配体交换法对NaGdF4纳米颗粒进行亲水性修饰：在单口玻璃瓶中用10mL 1,4-二氧六环溶解60mg不同分子量的P(AA-b-OEGMA)，随后置于60℃油浴中，预热20min。取30mgNaGdF4纳米颗粒溶解在10mL 环己烷中，通过滴液漏斗逐滴加入到上述单口瓶中，磁力搅拌、60℃条件下反应12h。反应结束后，在混合溶液中加丙酮离心，倒掉上清液，得到的白色沉淀物在真空干燥后用T H F 溶解，去离子水中透析48h，得到不同形貌的P(AA-b-OEGMA)-NaGdF4水分散液(PAO-NaGdF4)。

1.4 表征

核磁测试1HNMR 采用安捷伦VNMRS 600型核磁共振仪，溶剂采用氘代氯仿(CD3Cl)与氘代二甲亚砜(DMSO)，并以四甲基硅烷(TMS)为内标物；粒径测量采用英国马尔文仪器有限公司的粒度分析仪(DLS)，仪器型号M S-2000；形貌观察采用场发射透射电子显微镜(TEM)，仪器型号JEM-2100F，日本电子制造。

1.5 PAO-NaGdF4安全性的测定

合成的PAO-NaGdF4水溶液在PB S 缓冲液中透析，取第1、3、7天的透析液，采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-A ES)(O ptima-7300D V，U S A)测定透析液中Gd3+的浓度。PAO-NaGdF4的安全性通过Gd3+的泄漏率来评估，Gd3+的泄漏率用下式计算：

Leakagerate of Gd3+(%)=(Ct/C0)×100%

式中：Ct为不同时刻透析液中Gd3+的浓度；C0为PAO-NaGdF4水溶液中Gd3+的浓度。

1.6 PAO-NaGdF4体外弛豫率的测定

将不同形貌的PAO-NaGdF4水溶液稀释至含Gd3+浓度为0.05 mmol/L，0.1 mmol/L，0.2mmol/L，0.4 mmol/L，0.8mmol/L 的水溶液后，移至离心管中，并置于临床S iemensM agnetomT rio3.0T M R 成像仪中扫描，测得不同浓度的纵向弛豫时间(T1)，弛豫率(r1)由纵向弛豫时间T1的倒数对Gd3+浓度进行线性拟合得到。

2 结果与讨论

2.1 P(AA-b-OEGMA)的合成

图3 POEGMA 32(A)和P(AA 112-b-POEGMA 32)(B)的核磁共振氢谱图

我们合成了不同分子量P(AA-b-OEGMA)嵌段共聚物。对比实验证明，经P(AA112-b-OEGMA32)和P(AA32-b-OEGMA9)两种共聚物修饰的纳米水分散液最稳定。因此后续工作主要集中在这两种共聚物上。其中代表性的POEGMA32和P(AA112-b-POEGMA32)的核磁谱图示于图3。

从图3(A)中可以归属出，聚合物中属于OEGMA 中氢质子的峰位：δ=3.65处表示OEGMA 链上亚甲基(OCH2-CH2-O)的质子峰；δ=3.5处为OEGMA 末端中(OCH3)氢的质子峰；δ=0.8处为OEGMA 中在聚合物主链上(C-CH3)氢的质子峰。从图3(B)中可以看出δ=12.23处为PAA 链段中羧基(-COOH)氢的质子峰。核磁共振氢谱验证了线型嵌段聚合物P(AA112-b-POEGMA32)的成功合成。

2.2 经P(AA-b-OEGMA)嵌段共聚物表面修饰的NaGdF4纳米

图4 PAO-NaGdF4-NPs的透射电子显微镜图片(A,B)与动态光散射谱图(C)

我们发现，采用不同的P(AA-b-OEGMA)嵌段共聚物对预先制得的疏水性NaGdF4纳米颗粒进行亲水性修饰，即用羧基交换其表面的油酸，可得到稳定的不同形貌的亲水性NaGdF4纳米材料(PAO-NaGdF4)。例如，用P(AA32-b-OEGMA9)亲水性修饰时，可以得到稳定的单分散的PAO-NaGdF4纳米颗粒(PAO-NaGdF4-NPs)。图4(A,B)为不同分辨率下PAO-NaGdF4-NPs的T EM 照片，可以看出PAO-NaGdF4-NPs基本为均匀分散；图4(C)为PAO-NaGdF4-NPs在水溶液中的粒径分布图，可以看出PAO-NaGdF4-NPs的粒径在14 nm左右，并且分散较为均匀。

图5 PAO-NaGdF4-C luster的透射电子显微镜图片(A,B)与动态光散射谱图(C)

而当采用P(AA112-b-OEGMA32)对NaGdF4纳米颗粒进行亲水性修饰时，得到的是稳定的聚集态的PAONaGdF4纳米颗粒(PAO-NaGdF4-Cluster)。如图5(A,B)所示，不同分辨率下的T EM 照片显示PAO-NaGdF4-Cluster在水溶液中呈聚集态，每个聚集体由多个纳米颗粒团聚形成，且聚集体结构稳定，尺寸分布比较均匀；图5(C)可以看出PAO-NaGdF4-Cluster在水溶液中的粒径在180nm左右，粒径尺寸分布均匀。

以上结果表明，最终的NaGdF4纳米是单分散还是聚集体形貌，取决于所用的P(AA-b-OEGMA)的结构和分子量。当共聚物中的羧基(-COOH)链段较长时，同一聚合物链的聚羧基片段会修饰到不同NaGdF4的纳米表面，导致多个纳米颗粒被联接起来，从而最终得到聚集态的形貌。而聚合物中羧基含量较少时，同一聚合物链主要集中在同一个纳米颗粒表面，不会联接到其他纳米，因此可以得到单分散的NaGdF4的纳米。

2.3 PAO-NaGdF4纳米颗粒的安全性

图6 PAO-NaGdF4-NPs和PAO-NaGdF4-C luster的Gd3+泄漏率曲线

为满足临床应用，我们进行了Gd3+泄漏对比实验。图6中黑线为PAO-NaGdF4-NPs的Gd3+泄漏率曲线，红线为PAO-NaGdF4-Cluster的Gd3+泄漏率曲线，结果表明，两种纳米颗粒在七天内Gd3+几乎无泄漏，具有较高的安全性。

2.4 PAO-NaGdF4纳米颗粒的弛豫性能

图7 PAO-NaGdF4-NPs(A)和PAO-NaGdF4-C luster(B)的弛豫率

图7为两种纳米颗粒的弛豫率(r1)拟合图，从1/T 随Gd3+的浓度变化图斜率计算出的单分散PAO-NaGdF4纳米颗粒的相对r1值为5.59mM-1S-1；聚集态PAO-NaGdF4纳米颗粒的相对r1值为7.01 mM-1S-1。体外M R 成像研究证实，两种PAO-NaGdF4纳米颗粒均比商用Gd-BOPTA 造影剂(3.8mM-1S-1)有更高的弛豫率，具有临床转化前景。

3 结论

本研究合成了两种能用于磁共振T1造影的新型纳米造影剂PAO-NaGdF4-NPs和PAO-NaGdF4-Cluster，对其进行表征，并探讨二者纵向驰豫性能。两种纳米颗粒在水溶液中结构稳定，均无Gd3+泄漏。体外M R 成像研究表明，二者相较于大多数商用造影剂有更高的弛豫率，具有向临床应用造影剂转化的潜力。