虎杖根中黄酮类化合物对脂氧合酶活性抑制*

吴桂玲，孙赛兰，冯定坤，刘品祯

(黔南民族师范学院化学化工学院，贵州 都匀 558000)

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc)为寥科属多年生草本植物，主要分布于华东、中南、西南及河北、陕西、甘肃等地，它具有抗肿瘤、降压、降血脂、祛痰止咳、保肝、镇痛等药理作用[1]。虎杖的化学成分比较复杂，主要包括蒽醌类、虎杖苷、黄酮类、二苯乙烯类、酚性成分、大黄素等。黄酮类化合物在虎杖中含量较少，但是具有抗氧化、调节心血管系统等显著药理作用[2]。黄酮类化合物在抑制脂肪酶等方面也有一定的效果，是目前食品和医药品竞相开发的重点领域[3-4]。

脂氧合酶(lipoxygenase，LOX，ECl.13.11.12)，俗称脂肪氧化酶、是一种单核非血红素铁酶。最早是在大豆中发现的，在很多动植物中也存在，它能够催化植物体中的一些物质发生加氧反应，再经过一系列的作用，使植物体产生一些具有特殊风味的物质[5]，像谷子发生陈化[6]。已有研究发现茶叶产生陈味主要是由于茶叶中的LOX引起的[7]，动物体中的脂氧合酶主要是催化动物体中的花生四烯酸发生过氧化反应，高血压、肿瘤、哮喘、动脉粥样硬化等疾病的发生和发展都与LOX的代谢活性作用有关。有研究表明在前列腺癌和乳癌等癌症中，都有LOX的过表达[8-9]，抑制LOX可预防恶性肿瘤的发生。已有研究表明，植物中LOX与人和动物组织中LOX有相似的催化活性，Belman发现如果某种抗氧化剂能阻止花生四烯酸氧化，那么这种抗氧化剂也具有抗癌、防癌的作用[10]，这是因为哺乳动物中的脂氧合酶的结构与植物中的脂肪氧合酶结构类似，两种脂氧合酶对花生四烯酸的作用机理也相似。已有研究发现黄酮类化合物可以作用于脂氧合酶[11-12]，因此，借助于黄酮类化合物对大豆和毛尖茶叶中脂肪氧合酶活性的抑制作用，对于研究新工艺来开发合适的酶抑制剂有重要的指导意义。本研究以黔南州虎杖根为原料，以乙醇回流的方法提取了虎杖根中黄酮类化合物，并且探讨了虎杖根中黄酮类化合物和人工合成抗氧化剂BHA和BHT对大豆LOX和都匀毛尖茶叶中的LOX活性的抑制作用。为进一步研究植物LOX活性抑制机理奠定基础，该研究有助于将黄酮类化合物应用于体外筛选天然抗肿瘤活性物质。

1 实 验

1.1 材料、试剂及仪器

虎杖，采自贵州省都匀市，将虎杖根洗净置于电热恒温鼓风干燥箱中干燥后取出用高速万能粉粹机粉粹得最终样品，大豆,贵州产；毛尖茶叶采自都匀团山；芦丁(含量≥95.0%)，国药集团化学试剂有限公司；吐温20，阿拉丁；纯度为99.9%的亚油酸，阿拉丁；pH=6.3的麦氏缓冲溶液；叔丁基茴香醚(BHA)；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，其他化学试剂均为分析纯。

CL-2型恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；多功能粉碎机，永康市速锋工贸有限公司；DHG-9243BS-III型电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；FA2004电子分析天平，天津天马衡基仪器有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；GTR21-1高速冷冻离心机，上海赵迪生物科技有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-DIII循环水式多用真空泵，郑州英三谷华仪器有限公司；PHS-3C精密pH计，上海盛磁仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 虎杖根中黄酮类化合物的提取

准确称取虎杖根样品2.0000 g于圆底烧瓶中，加入石油醚进行加热回流1 h，抽滤，弃滤液，留滤渣，将滤渣置于圆底烧瓶中用70%的乙醇60 mL于80 ℃进行回流提取两次，每次2 h，再抽滤，将滤液进行旋转蒸发，得到膏状物，加入一定体积的无水乙醇和少量的无水甲醇溶解，定容至250 mL或100 mL待测。

1.2.2 芦丁标准曲线制作

将芦丁标准品充分干燥直至重量不再发生变化，准确称取样品0.0200 g，用少量无水甲醇和一定体积的无水乙醇配置浓度为0.20 mg/mL的芦丁标准溶液100 mL。

在7支25 mL的容量瓶中分别加入0.00，1.00，2.00，3.00，5.00，7.00，9.00 mL芦丁标准溶液，在每支容量瓶中加入质量分数为5%的亚硝酸钠溶液1.00 mL，充分摇匀，放置6分钟；再加入5%的硝酸铝溶液1.00 mL，再次摇匀后，放置5分钟；最后加入4%的氢氧化钠溶液10.00 mL，摇匀，接着用无水乙醇定容，放置15分钟至20分钟，在最大吸收波长500 nm处测定溶液的吸光度A，以试剂作空白对照，记录数据，不同浓度c的芦丁标准溶液会测得不同的吸光度A，用A为纵坐标，c为横坐标，绘图。

1.2.3 虎杖根中黄酮类化合物含量的测定

在波长为500 nm处测定吸光度。分别取适量待测液于25 mL 容量瓶中，再按照1.2.2的操作步骤依次在容量瓶中加入NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液、NaOH溶液，摇匀，最后用无水乙醇溶液定容，按照1.2.2的操作步骤，根据1.2.2得到的回归方程，计算出黄酮类样品的浓度。

1.2.4 大豆中LOX的提取[3]

先用蒸馏水洗净大豆，在0～10 ℃的温度下先把大豆磨碎，然后再用石油醚进行多次浸提，最后得到脱脂大豆粉。称取脱脂大豆粉24.3 g，以料液比为1:10(g/mL)，加入243 mL的去离子水，调pH值至4.5，搅拌50 min，抽滤；向滤液中加入固体硫酸铵使其饱和度达到40%，将滤液低温(4 ℃左右)离心20 min；再次加入固体硫酸铵到上清液中，使溶液的饱和度达到60%。再离心20 min，用pH 9.0的0.2 mol/L的硼酸盐缓冲液溶解沉淀，得到大豆粗酶液，低温冷藏备用。

1.2.5 大豆中LOX的活性测定[3]

底物的制备：先配制pH值为9.0的硼酸盐缓冲溶液，使其浓度为0.2 mol/L，然后取0.25 mL吐温20分散在硼酸盐缓冲溶液中，边摇动溶液边滴加亚油酸0.27 mL，使它们混合均匀，再加入1 mol/L的NaOH溶液，边加边摇动，直到使整个体系澄清，将溶液pH值调到9.0，然后用硼酸盐缓冲液定容到500 mL作为底物备用。

用分光光度法测定茶叶脂氧合酶(LOX)的酶活性。以温度60 ℃，pH值为6.3，15 mL反应体系，其中底物为亚油酸钠，以最大吸收波长234 nm处的吸光度值每分钟增加0.001个单位定义为一个酶活单位。具体操作如下：15 mL反应体系中含粗酶液1.0 mL，亚油酸钠母液250 μL，以及缓冲液。在水浴中反应，水浴温度为50 ℃，反应2 min时测一次234 nm处的OD值，反应4 min时再测一次，观察两次OD值的变化，进行3次平行实验。

式中：A为酶活性单位：OD4 min为反应4 min的OD值；OD2 min为反应2 min的OD值。

1.2.6 黄酮类化合物对大豆LOX活性抑制测定

在5只洁净干燥的试管中加入黄酮类化合物，体积分别为4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL的黄酮类化合物，将5只试管分别按照1.2.5中测定酶活性的步骤操作，整个反应体系都一样，只是多了一定体积的黄酮类化合物，测出反应液在234 nm 出的活性，按照抑制率计算公式计算：

式中：A0为无黄酮类化合物时的酶活力；A1为加黄酮类化合物时的酶活力。

1.2.7 都匀毛尖茶叶中LOX的提取[13]

将新鲜的毛尖茶叶晾干后剪碎，称取10 g剪碎的茶叶，准确量取200 mL的麦氏缓冲液与茶叶混匀2分钟后将混合液过滤，取滤液低温高速离心5 min，取上清液，向上清液中加入固体(NH4)2SO4使溶液的饱和度为30%，在冰箱中静置4 h。再次将溶液低温高速离心5 min。在上清液中加入固体硫酸铵使其饱和度为70%。将溶液放入冰箱中静置24 h左右，将溶液低温离心10 min，进行过滤，将沉淀用麦氏缓冲溶液进行溶解，溶液即为茶叶的粗酶液，放入冰箱冷藏备用。

1.2.8 都匀毛尖茶叶中LOX活性的测定

方法同1.2.5，将大豆脂氧合酶酶液换为都匀毛尖茶叶的脂氧合酶酶液。

1.2.9 黄酮类化合物对毛尖茶叶LOX活性抑制的测定

方法同1.2.6，将大豆脂氧合酶酶液换为都匀毛尖茶叶的脂氧合酶酶液。

2 实验结果

2.1 芦丁标准曲线的绘制

在最大吸收波长500 nm处测定溶液的吸光度A，以试剂作空白对照，记录数据，不同浓度c的芦丁标准溶液会测得不同的吸光度A，用A为纵坐标，c为横坐标，绘图，可以得到芦丁标准曲线回归方程为y=10.87412X + 0.0086，相关系数R2=0.9995。结果见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 虎杖根中黄酮类化合物含量测定

由2.1得到的回归方程，可以计算出虎杖根中黄酮类化合物的提取率为16.92%。

2.3 大豆LOX活性测定

根据1.2.5酶活力计算公式，在60 ℃，pH值6.3下，大豆LOX的酶活力A=37.165。

2.4 虎杖根黄酮类化合物以及BHA、BHT对大豆LOX的抑制作用

在温度为60 ℃，pH为6.3，浓度相同条件下，虎杖根黄酮类化合物和BHA、BHT均可以抑制大豆脂肪氧合酶活性，随着浓度的增加，抑制率逐渐增强。见图2。计算得：BHA：IC50=1.89 mg/mL，BHT：IC50=1.77mg/mL，虎杖根黄酮：IC50=12.53 mg/mL。

图2 虎杖根黄酮、BHA和BHT对大豆LOX的抑制率Fig.2 Theinhibition rate for LOX in soybean of flavonoids from the root of Polygonum cuspidatum, BHA and BHT

2.5 茶叶中LOX的活性测定

根据1.2.5酶活力计算公式，在60 ℃，pH值6.3下，茶叶LOX酶活力A=33.1。

2.6 虎杖根黄酮类化合物以及BHA、BHT对毛尖茶叶LOX的抑制作用

在温度为60 ℃，pH为6.3，浓度相同条件下，虎杖根黄酮类化合物和BHA、BHT均可以抑制毛尖茶叶LOX活性，随着浓度的增加，抑制率逐渐增强。见图3。计算得：BHA:IC50=1.98 mg/mL，BHT：IC50=1.76 mg/mL，虎杖根黄酮：IC50=9.17 mg/mL。

图3 虎杖根黄酮、BHA和BHT对毛尖茶叶LOX的抑制率Fig.3 Theinhibition rate for LOX in Maojian tea of flavonoids from the root of Polygonum cuspidatum, BHA and BHT

2.7 讨 论

相同条件下，黄酮类化合物对大豆和毛尖茶叶LOX抑制性与人工合成抗氧化剂BHA和BHT对LOX活性的抑制性都不同，可能是由于不同的抗氧化剂他们的结构也不相同[14]。以前的研究发现密蒙花中的黄酮类化合物也可以抑制大豆脂氧合酶的活性[3-4]，本实验发现虎杖根总黄酮对大豆LOX和毛尖茶叶中的LOX的也都有一定的抑制作用。虎杖根黄酮类化合物对大豆LOX活性的抑制性比对茶叶LOX活性的抑制性稍微弱些，可能是由于大豆LOX的活性比毛尖茶叶LOX的活性稍强。

3 结 论

本实验以虎杖根为原料，以乙醇回流法提取了虎杖根中的黄酮类化合物，得到的提取率为16.92%。虎杖根中黄酮类化合物对大豆LOX有一定的抑制作用，也可以抑制毛尖茶叶LOX的活性，在温度为60 ℃，pH为6.3条件下，虎杖根黄酮对大豆LOX和毛尖茶叶LOX活性的抑制性随着黄酮类化合物和人工合成抗氧化剂浓度的增大而逐渐增强，人工合成抗氧化剂对LOX的抑制性比虎杖根黄酮类化合物的抑制性强，黄酮类化合物对毛尖茶叶LOX活性的抑制性比对大豆LOX的稍微强些。通过此研究有助于将黄酮类化合物应用于体外筛选天然抗肿瘤活性物质研究奠定理论基础。