黑色小扁豆中不同结合态酚类含量、花青素组成及其抗氧化活性研究

李文婷 邹安迪 李红艳 邓泽元 张 兵

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047）

小扁豆（Lentil,Lens culinaris）是一种重要的豆科类作物，在所有可食用豆科类作物中，小扁豆特别是黑色小扁豆的高营养价值越来越受到人们的关注[1]。小扁豆含有大量的营养素、微量营养素以及植物化学成分。现有研究[2]表明，小扁豆中富含益生元，可以有效降低肥胖的发生。小扁豆中含有的多酚类植物化学物具有显著的抗氧化、抗炎活性。

豆类植物具有较高的抗氧化性与其含量丰富的多酚、黄酮及花色苷等物质密切相关[3-5]。有研究表明[1，6-9]，存在于植物中的天然抗氧化剂如多酚、生育酚、类胡萝卜素等植物化学物，可以起到保持人体健康，预防慢性疾病的作用。植物体中的天然多酚类物质主要包括酚酸、黄酮和单宁类物质[10]。花青素是一种水溶性色素，属类黄酮化合物，广泛存在于有色植物果实、花朵及子叶中，具有很强的抗氧化能力[11-12]，可以预防心血管疾病，预防DNA损伤，抗炎作用，抑制脂质过氧化反应[13-14]。

存在于植物中的酚类物质主要包括两部分：有机溶剂可提取的可溶性酚类和有机溶剂不可提取的结合态酚类。可溶性酚类物质除以游离形态存在外，还可通过酯键、醚键、糖苷键的形式与其它物质结合[15]。通过碱水解处理可破坏酯键和醚键，酸水解处理破坏糖苷键。将有机溶剂提取后的上清液用碱、酸水解处理并萃取，可从有机溶剂提取液中分别提取出游离态酚类、酯键合态酚类、糖苷键合态酚类；对于残渣中存在的有机溶剂不可提取的结合态酚类物质主要以酯键、醚键、糖苷键与细胞壁中的纤维素、半纤维素、蛋白质、果胶等物质结合[16-17]，可通过酸水解、碱水解或酶水解破坏物质间的化学键[18-19]，以提取酚类物质。文献[10]、[20]、[21]研究了红枣中酚类物质，分别提取出游离态、酯键合态、糖苷键合态和碱解结合态酚类。彭瀚等[22]对黑豆经甲醇溶液提取处理，上清液为可溶性酚类，残渣进行酸水解、碱水解处理，可得到甲醇不可提取的结合态酚类。目前，对小扁豆中花青素成分的研究文献较少。Takeoka等[23]利用HPLC和NMR鉴定出黑色小扁豆中的花青素成分为飞燕草-3-O-（2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷）。

有关小扁豆不同存在形式的酚类物质（游离态、酯键合态、糖苷键合态、结合态）的含量及其抗氧化活性鲜见研究报道。基于前人对酚类物质及小扁豆植物化学物的相关研究，本研究目的是评价小扁豆中游离态、酯键合态、糖苷键合态和结合态酚类的含量，进行体外抗氧化活性研究，并鉴定其花青素成分。

1 材料与方法

1.1 原料

黑色小扁豆，2015年3月购于加拿大圭尔夫当地超市

1.2 试剂、仪器与设备

没食子酸、儿茶素、奎诺二甲基丙烯酸酯（Trolox）、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、2，2-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），西亚试剂；福林酚试剂，上海荔达生物科技有限公司；无水甲醇、FeCl3·6H2O、乙酸乙酯、盐酸、硫酸、冰醋酸、K2S2O8、三水醋酸钠、NaOH，西陇科学股份有限公司；乙醚，国药集团化学试剂有限公司；AlCl3，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；Na2CO3、NaNO2、FeSO4，西陇化工股份有限公司。

AL104电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；BioTek酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；HY-2调速多用振荡器，上海比朗仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，常州市华普达教学仪器有限公司；N-1100旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 酚类物质提取及测定

准确称取1.00 g研磨好的黑色小扁豆粉末于50mL离心管中，按1∶15的料液比加入15mL 80%甲醇-水（V/V）溶液，室温下超声提取1 h，4 200 g离心10min，收集上清液，重复提取4次，合并甲醇提取液，用于游离态、酯键合态和糖苷键合态酚类分析，残渣用于结合态酚类分析。将样品放在-20℃冰箱储存备用。

1.3.1 小扁豆甲醇提取液的制备[10，20-21]

1）游离态酚类的制备 将小扁豆甲醇提取液于35℃旋转蒸发至20mL，用6mol/L HCl调pH值至2，该部分酚类物质通过加入等体积有机溶剂（体积比1∶1的乙醚-乙酸乙酯混合溶液）进行萃取，震荡萃取30min，静置分层后分液，重复萃取5次。将萃取分离的有机相合并，在35℃条件下旋转蒸发至干，复溶于5mL 80%甲醇中，即游离态酚类提取物，将样品放在-20℃冰箱储存备用。

2）酯键合态酚类的制备 向上述提取过游离态酚类的水相中加入10mL 4mol/L NaOH溶液，同时充入氮气，室温下摇床震荡反应4 h，用6 mol/L HCl调pH值至2，该部分酚类物质萃取过程同上。

3）糖苷键合态酚类的制备 向上述提取完酯键合态酚类的水相中加入4mL HCl，85℃水解反应30min，该部分酚类物质萃取过程同上。

1.3.2 小扁豆结合态酚类的制备[10，22]

1）碱解结合态的制备 将甲醇提取后的残渣加入20mL 2mol/L NaOH溶液中，同时充入氮气，室温下摇床震荡4 h，用6mol/L HCl调整pH值至2，4200 g离心10min，收集上清液，该部分酚类物质萃取过程同上。

2）酸解结合态的制备 将甲醇提取后的残渣加入25mL 2mol/L HCL溶液中，同时充入氮气，在85℃水浴中保持1 h后，用10mol/L NaOH将溶液pH值调至2，4200 g离心10min后收集上清液，该部分酚类物质萃取过程同上。

1.3.3 小扁豆中总酚含量的测定[24-25]总酚含量的测定采用Folin-Ciocalten法，以没食子酸（gallic acid）为标准品，选用96孔板测定。将25μL样品或标准品溶液和125μL福林酚试剂（0.2mol/L）于室温下反应10min，加125μL饱和Na2CO3溶液（10 g/100mL），在振荡器上缓慢摇匀后室温下反应30min，在波长765 nm处测定吸光度。由没食子酸系列标准溶液制作标准曲线，计算样品总酚含量，结果表示为mg GAE/g DW（GAE即Gallic acid equivalent）。

1.3.4 小扁豆中黄酮含量的测定[24-25]总黄酮的测定采用亚硝酸钠-三氯化铝法，以儿茶素（catechin）为标准品，选用96孔板测定。25μL样品或标准品溶液与110μL NaNO2（0.066mol/L）室温混合，反应5min后加入15μL AlCl3（0.75mol/L）溶液反应6min，最后加入100μL NaOH（0.5mol/L）溶液，在振荡器上缓慢摇匀，室温反应10min，在510 nm处测定吸光度。由儿茶素系列标准浓度制作标准曲线，计算样品总黄酮含量，结果表示为mg CAE/g DW（CAE即Catechin equivalent）。

1.3.5 亚铁离子还原能力（FRAP）测定[24-25]

试验试剂的配制：

1）40mmol/L盐酸溶液 取浓盐酸（12mol/L）0.1mL加水至30mL。

2）20mmol/L三氯化铁溶液 称取0.2703 g的FeCl3·6H2O，用超纯水定容50 mL。

3）0.3mol/L醋酸钠缓冲溶液 称取三水醋酸钠0.31 g，加冰醋酸1.6mL，然后用超纯水水稀释定容100mL。

4）10mmol/L TPTZ溶液 称取TPTZ样品31.233mg，用40mmol/L盐酸定容10mL，置于4℃冰箱中保存。

5）FRAP工作液 醋酸钠缓冲溶液、三氯化铁溶液和TPTZ溶液按体积比10∶1∶1混合，制得质量浓度为0.04mg/mL的工作液，现用现配。

试验方法：加10μL样品或FeSO4标品溶液及180μL预热至37℃的FRAP工作液至96孔板，在振荡器上避光摇匀，37℃反应10min，于波长593 nm处测定其吸光度值。以FeSO4系列标准溶液制作标准曲线。样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需FeSO4的物质的量（mmol Fe/g DW）表示。

1.3.6 DPPH自由基清除能力测定[24-25]加100 μL DPPH甲醇溶液（0.065mmol/L）与100μL样品或空白溶液于96孔板中，避光条件下在振荡器上缓慢摇匀，室温反应30min，使用酶标仪在517 nm处测定其吸光值。以Trolox为标准测定，样品DPPH清除能力以达到同样消除率所需Trolox的质量（mg TE/g DW）表示（TE：Trolox equivalent）。清除率计算公式：

式中：Ai——样品溶液加DPPH试剂混合液的吸光度；Aj——样品溶液加甲醇的吸光度；Ac——DPPH溶液加样品溶剂的吸光度。

1.3.7 ABTS自由基清除能力测定[24，26]试验试剂的配制：将5mL 7.0mmol/L ABTS储备液与88 μL 140mmol/L K2S2O8混匀，静置12～16 h，配制ABTS工作液。ABTS工作液用80%的甲醇稀释，使混合溶液在734 nm处吸光值为0.7±0.02。

将200μL ABTS溶液和20μL样品或标品溶液分别加入96孔板中，避光条件下在振荡器上缓慢摇匀，室温反应6min，在波长734 nm处测定吸光值。以Trolox为标准测定，样品ABTS清除能力以达到同样消除率所需Trolox的质量（mg TE/g DW）表示（TE，Trolox equivalent）。清除率计算公式：

式中：A0——ABTS溶液和样品溶剂混合液的吸光度；Ai——ABTS溶液和样品溶液混合液的吸光度；Aj——80%甲醇和样品溶液的吸光度。

1.4 黑色小扁豆中花青素的提取及组成鉴定

1.4.1 黑色小扁豆花青素提取物的制备 准确称取1.00 g研磨好的小扁豆粉末于50mL塑料离心管中，按料液比1∶15加入15mL提取液，提取液为含1%HCL的80%甲醇-水（V/V）溶液，室温下避光超声提取1 h，4 200 g离心10min，收集上清液，重复提取4次，合并甲醇提取液，在35℃条件下旋转蒸发至干。将残留物溶解于10mL蒸馏水中，样品过0.22μm的MCE滤膜，用于鉴定花青素成分。

酸解花青素提取物：避光条件下在上述提取液中加入盐酸溶液，使盐酸终浓度为2mol/L，同时充入氮气，室温下摇床震荡提取1 h，加入等体积有机溶剂（体积比为1∶1的乙醚-乙酸乙酯混合溶液），重复提取5次。将提取分离的有机相合并，在35℃条件下旋转蒸发至干，将残留物溶解于10 mL蒸馏水中，待测，样品过0.22μm的MCE滤膜，用于鉴定花青素成分。

1.4.2 HPLC-ESI-QQQ-MS鉴定花青素 液相条件：色谱分离采用HPLC系统（Agilent 1290 infinity series），包含脱气机、二元泵（Bin Pump SL）、进样器（HiP-ALS）、柱温箱（TCC SL）、DAD检测器（Agilent Technologies,Santa Clara,USA）。使用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250mm，5μm）。流动相含0.1%的甲酸水溶液（A）和含0.1%的甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱程序为：0～5 min,8%～12%B；5～10 min,12%～18%B；10～13min,18%B；13～20min,18%～25%B；20～32 min,25%～38%B；32～36 min,38%B；36～38min,38%～8%B。进样量5μL，柱温30℃，流速0.8mL/min，DAD 520 nm。

质谱条件：质谱检测采用三重串联四级杆质谱仪（Agilent 6430 QQQ），装备电喷雾离子源（ESI），采用正离子模式用于精密质量测定。全质谱数据在m/z 50～1 000质量范围获得。最佳质谱参数如下：毛细管电压3.5 kV，进样锥电压35 V，去溶剂化气流（N2）速度为900 L/h，进样锥气流（N2）速度为50 L/h，去溶剂温度325℃，离子源温度150℃，裂解电压120 V。

1.5 数据处理

试验数据表示为平均值±标准差（mean±SD，n=3）。对数据采用SPSS统计软件分析，方差分析（ANOVA）用于显著性分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

表1 黑色小扁豆可溶性和结合态提取物酚类、黄酮含量Table1 Phenolic and flavonoid content of soluble and bound phenolic extracts of black lentil

2 结果与分析

2.1 总酚和总黄酮含量

黑色小扁豆的酚酸及黄酮含量见表1。不同存在形式酚类提取物中酚酸、黄酮含量有显著性差异（P＜0.05），其中酯键合态酚类物质酚酸含量最高，达1.61mg/g，碱解结合态酚类物质黄酮含量最高，可达1.07mg/g，而糖苷键合态酚类物质酚酸、黄酮含量最低，分别为0.16mg/g和0.14mg/g。对于残渣中黄酮含量的测定结果是：碱解处理明显高于酸解处理，可能是因为黑色小扁豆中黄酮主要以酯键、醚键与纤维素、半纤维素、淀粉、果胶等物质结合，经碱解处理破坏化学键，将黄酮释放出来。Fratianni等[27]研究表明，小扁豆总酚含量为1.09～1.59mg/g，低于本试验研究结果；而张兵等[25]对20种加拿大红色和绿色小扁豆的研究表明，总酚、总黄酮含量分别为4.56～8.34mg/g和0.6～1.98 mg/g；Xu等[28]用不同溶剂提取小扁豆中的酚类物质，其总酚、黄酮含量分别为1.02～7.53 mg/g和0.72～2.21mg/g；Yeo等[17]对4种脱脂后的小扁豆进行研究，其可溶性、碱解结合态提取物酚类含量分别为3.22～4.03mg/g和3.00～3.64mg/g，黄酮含量分别为2.30～3.11mg/g和1.55～2.28mg/g。在比较小扁豆中酚类含量时，本试验结果低于其它报道，这可能是由于所用原料区域、品种及总酚提取方法的差异所致。

2.2 总还原能力FRAP

黑色小扁豆中游离态、酯键合态、糖苷键合态和结合态酚类提取物的总还原能力见表2。不同存在形式酚类提取物的FRAP值之间有显著性差异，主要分布在6.25～43.80mmol/g之间，其中碱解结合态的总还原能力最强，其次是糖苷键合态。赵艳等[29]研究豇豆属、小扁豆属、鹰嘴豆属、菜豆属、蚕豆属等豆类的抗氧化活性，结果表明：定西小扁豆、榆林扁豆的FRAP值分别是1.48mmol/g和1.03mmol/g，总还原能力低于本研究结果。

2.3 DPPH自由基清除能力

黑色小扁豆中游离态、酯键合态、糖苷键合态和结合态酚类物质DPPH自由基清除能力见表2。不同存在形式酚类提取物的DPPH清除能力之间有显著性差异，清除能力主要分布在0.15～2.13 mg/g之间，其中碱解结合态的清除能力最强，其次是游离态，碱解结合态清除能力最弱。Xu等[28]用不同溶剂提取小扁豆中的酚类物质，DPPH为0.91～19.61μmol/g。Yeo等[17]对4种脱脂的小扁豆进行研究，其可溶性、碱解结合态酚类提取物的DPPH自由基清除能力分别为5.22～6.67mg/g和4.73～5.51mg/g，此结果高于本研究结果，可能是因原料品种及提取物中所含酚类物质种类及含量不同所致。

2.4 ABTS自由基清除能力

黑色小扁豆中游离态、酯键合态、糖苷键合态和结合态酚类物质的ABTS自由基清除能力见表2。不同存在形式酚类提取物的ABTS清除能力之间有显著性差异，清除能力主要分布在0.74～3.92 mg/g之间，其中碱解结合态的清除能力最强，其次是酸解结合态，游离态提取物清除能力最弱。

表2 黑色小扁豆可溶性和结合态提取物的抗氧化能力Table2 Antioxidant activity of soluble and bound phenolic extracts of black lentil

2.5 黑色小扁豆花青素成分鉴定结果

图1a为黑色小扁豆甲醇提取物在520 nm处的液相图谱，Rt在9.892min有特征吸收峰；图1b为该保留时间处的高效液相三重串联四级杆质谱（HPLC-QQQ-MS）图。由母离子m/z 597.2和碎片离子m/z 303.3、435.2可推断：单体为飞燕草素，母离子和碎片离子的相对分子质量差分别为294和162，分子中含一个单糖糖苷和一个阿拉伯糖糖苷。结合文献[23]推测m/z 597.2的花青素结构为飞燕草素-3-O-（2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷）。

图1 黑色小扁豆甲醇提取液中花青素在520 nm的液相色谱图（a）和峰1的质谱图（b）Fig.1 HPLC profile of methanolic extracts of black lentil at 520 nm（a）and MS/MS spectrum（b）of peak

图2a为黑色小扁豆甲醇提取物经酸水解后在520 nm处的液相图谱，可看出，酸解提取的花青素中有2个明显的峰：图2b、2c分别为Rt在13.482min（A1）和16.007min（A2）保留时间处的高效液相三重串联四级杆质谱（HPLC-QQQMS）图。由母离子m/z 303.1并结合520 nm处的特征吸收峰可推断出含有飞燕草素单体，由母离子m/z 287.1结合520 nm处的特征吸收峰可推断出含有矢车菊素单体。

由图2可知，小扁豆甲醇提取物经盐酸水解处理后可鉴定出2种花青素单体，分别为飞燕草素单体和矢车菊素单体。其中，飞燕草素成分在甲醇提取物520 nm处的液相图中（图1a）有明显的吸收峰。结合质谱图及文献[23]可推断为飞燕草素-3-O-（2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷）；矢车菊素成分在甲醇提取物520 nm处的液相图中没有吸收峰，可能是因为矢车菊素单体与其它物质以糖苷键的形式结合在一起，经酸处理后可以破坏糖苷键，将矢车菊素单体释放，从而在520 nm处有明显的吸收峰，该物质为矢车菊素衍生物。

图2 黑色小扁豆甲醇提取液酸解后在520 nm的液相色谱图（a），以及峰A1（b）和峰A2（c）的质谱图Fig.2 HPLC profile of acid hydrolyzed extracts of black lentil at 520 nm（a）and MS/MS spectrum of peak A1（b）and peak A2（c）

3 结论

分别对80%甲醇溶液提取的上清液和残渣中不同存在形式的酚类进行分离提取，结果表明，小扁豆中不同存在形式的酚类提取物含量及其抗氧化能力有一定差异，其中酯键合态酚类提取物的总酚含量较高，为1.61mg/g，碱解结合态酚类提取物具有较高的黄酮含量、亚铁离子还原能力、DPPH清除能力、ABTS清除能力，其值分别为1.07mg/g、43.80mmol/g、2.13mg/g、3.92mg/g。采用HPLC-QQQ-MS鉴定黑色小扁豆中的花青素成分，结果表明黑色小扁豆中花青素主要为飞燕草-3-O-（2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷）及矢车菊素衍生物，这为黑色小扁豆的进一步开发利用提供了科学依据。