藻类基因编辑技术研究进展

何婕培

（中国海洋大学鱼山校区 山东青岛 266000）

基因编辑技术是一种对基因组中特定DNA 片段进行碱基的添加、删除或替换的技术。核酸内切酶和特定的蛋白在基因编辑中起重要作用，其中核酸内切酶广泛应用于DNA 的定点切割，可识别和剪切特定的DNA 序列；特定的蛋白，例如锌指蛋白可识别和结合特定的DNA 序列，Cas9 蛋白可结合和切割特定的DNA 序列。当定点切割靶序列完成后，细胞固有的非同源末端连接（non-homologous end-joining，NHEJ）修复过程与这些融合蛋白联手，就能导致基因组定点插入、删除或移码突变，引起外源DNA 插入、基因功能缺失等［1］。

近年来，随着高通量测序技术的高速发展，已有多种海洋藻类完成了基因组测序，褐藻中的海带（Saccharina japonica）和长囊水云（Ectocarpussiliculosus），绿藻中的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和团藻（Volvox carteri），硅藻中的三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和灰胞藻（Cyanophora paradoxa）等［2-4］，为海洋藻类学研究提供了丰富的遗传基因资源。然而海洋藻类，特别是大型海藻，普遍存在生长周期长、遗传转化方法不成熟、各种分子生物学研究在藻类中起步晚的特点，这为基因编辑技术在藻类中的开展带来了难度。而CRISPR／Cas9 技术作为目前热门且简单的基因编辑技术，2013年就首次成功应用于植物的基因组编辑中［1］。CRISPR／Cas9 基因编辑技术逐步成熟，目前CRISPR／Cas9 基因编辑技术作为较为简单方便的基因编辑方法，已应用于多种植物，包括拟南芥、水稻、烟草、大豆、玉米、高粱等植物中［5］。

图1 Cas9 蛋白示意图

图2 CRISPR／Cas9 流程图

1 CRISPR／Cas9 技术在微藻中的应用

2014年，Jiang 等［6］首次将CRISPR／Cas9 技术应用于藻类中，构建Cas9 和gRNA 载体转化至莱茵衣藻中，培养24 h 后观察到基因的瞬时表达，但没有得到稳定遗传的突变株。Nymark 等［7］利用三角褐指藻内源的叶绿素a／c 结合蛋白基因（LHCF2）和U6 启动子分别调控Cas9 与gRNA 的转录，实现了对叶绿体信号识别因子54（CPSRP54）的定点突变，得到了稳定遗传的转化株，并利用高分辨率溶解曲线的方法进行突变结果的检测，这是该方法首次应用于藻类的基因编辑研究。Shan 等［8］在微拟球藻（Nannochloropsis）中对硝酸还原酶基因进行了定点突变，得到的突变株在含有NH4Cl 的培养基中能正常生长，但是NaNO3对其有致死作用。该研究组进一步改进了检测方法，比较了基因组DNA 是否经过酶切对转化效率的影响，以及PCR 的产物直接进行高通量测序可验证碱基突变的发生。

表1 CRISPR／Cas9 技术在藻类中的应用

2 CRISPR／Cas9 系统在大型海藻中应用存在问题

2.1 成熟的遗传转化方法 植物常用的转入外源基因的方法包括基因枪法、农杆菌转化法、PEG介导转化法、电穿孔法等。微藻中使用的转化方法较为成熟，其中电穿孔法为常用的转化方法，已能成熟运用并实现稳定遗传［9］。成熟的遗传转化方法，对于外源基因导入受体细胞，起到至关重要的作用。同时，对于提高受体细胞的转化率，提高成功转化的细胞成活率也很重要。可以说，成熟的遗传转化体系是CRISPR／Cas9 技术在大型藻类中成功运用的基础。

2.2 富集成功转化的细胞 成功将外源基因导入藻类细胞后，常用抗生素的方法筛选成功转化的细胞，其中潮霉素和氯霉素用于筛选条斑紫菜叶状体的遗传转化研究，常见的筛选抗生素还包括氨苄、除草剂等［9］。在CRISPR／Cas9 基因编辑系统，转入CRISPR／Cas9 表达载体后，可同时得到成功突变的和未发生突变的个体；区别得到并富集突变个体至关重要，直接影响到后期的检测结果与突变个体的后续培养。

3 CRISPR／Cas9 技术已有研究对大型海藻中的指导意义

CRISPR／Cas9 技术在微藻中有成功运用的实例［6］，其在海洋大型藻类的运用也具有理论可行性。研究表明，通过对外源基因的密码子优化和使用内源性强启动子可提高外源表达载体在海藻中的表达效率，由于藻类基因组中通常有较高的GC含量，因此在密码子的偏好性上更倾向于使用G和C［10］。现已有研究对大型藻类中的指导意义如下，主要从3 个方面进行改进：转入载体的优化、遗传转化方法的选择和编辑效率的提高。

3.1 载体的优化

3.1.1 Cas9 序列优化 相关研究人员已经证实，Cas9 基因密码子是否进行优化，在高等植物中的编辑效率不同。Nymark 等［7］通过优化Cas9 的密码子，并采用藻体内源的启动子启动Cas9 和sgRNA的转录，显著提高了CRISPR／Cas9 系统在三角褐指藻中的基因编辑效率，使得基因编辑效率达31%，同时通过在1 个靶基因上运用2 个sgRNA，基因编辑效率提高至25%～63%。研究表明，人类细胞和水稻的密码子偏好性对Cas9 基因进行优化后，用于编辑水稻基因组中的同一位点，虽然都获得了能稳定遗传的转化株，但编辑效率不同：根据水稻基因组优化的Cas9 基因突变效率明显高于根据人类细胞优化的Cas9 基因的突变效率。在玉米的原生质体基因编辑实验中，也得到了与水稻中相同的实验结果［11］。通过以上论述，为了使该系统在大型海藻中更高效地发挥作用，需要根据相应物种的核心基因集的密码子偏好性对其进行基因优化，连入CRISPR／Cas9 表达载体中。

3.1.2 启动子的选择 通常情况下，细胞中RNA聚合酶Ⅱ类启动子主要介导编码蛋白质基因的表达，不能调控非编码RNA 的转录。在已知的高等植物和动物的细胞核中，RNA 聚合酶Ⅲ类启动子会识别并转录非编码RNA。所以在构建载体的过程中，常用该类启动子进行gRNA 的转录。此外，改造后的Ⅱ类启动子也可进行小RNA 的转录。至目前为止，应用于植物中进行gRNA 转录的主要是内源性RNA 聚合酶Ⅲ类启动子，例如拟南芥U6 启动子、水稻U6 启动子、水稻U3 启动子及水稻tRNA 启动子等［4，12］，也有使用CAMV35s 启动子成功转录gRNA 的研究［6］。2014年，Jiang 等［6］利用拟南芥的U6 启动子转录gRNA 后，在莱茵衣藻中得到成功的表达。研究表明，虽然外源的启动子也有功能，但是选取目标物种的内源启动子，对该项技术在其中的运用非常重要。

3.2 遗传转化方法的选择

3.2.1 基因枪转化 研究表明，基因枪的转化率较低，并且在各物种中的变化范围较大，转化率通常在10-3～10-2之间。条斑紫菜质体遗传转化体系的建立，优化了基因枪轰击参数，当真空度为28 mmHg，轰击距离为6 cm，氦气压力是1 350 psi时，转化效率最高，约为4.2‰［9］。目前基因枪介导的外源基因转化方法，在海洋大藻中运用较普遍，并且经过转化后，能得到稳定表达个体。

3.2.2 其他转化方法 关于大型外源基因的转化方法，采用了多种方法。其中包括证明了PEG转化法和农杆菌转化法在紫菜原生质中应用的可行性，以及电击转化法在紫菜原生质中的应用，但这些转化方法都具有一定的局限性，有待进一步优化和改进。尝试多种转化方法，并得到一套成熟的遗传转化体系，对于基因编辑技术的成功运用，编辑效率的提高，都有重要意义。

3.3 编辑效率的提高 据文献报道，所有成功转入载体的个体不可能全部发生基因编辑，预计只有30%～40%的成功转化株会发生突变：生物介导的转化方法会导致Cas9 基因序列的断裂和不完全 融合［13］。然 而Cas9 序列 和sgRNA 序列的 完 整性是基因突变发生的必要条件，与农杆菌转化突变率在20%～90%相比［13］，当采用生物技术的轰击转入外源基因时，基因枪转化的突变率更低，在5%～12%之间［14］。所以，通过Cas9 序列的优化、内源启动子的运用、转化方法的选择，这些步骤都能在一定程度上提高CRISPR／Cas9 系统在大型海藻体内的编辑效率。

4 展望

CRISPR／Cas9 技术运用广泛，几乎可在所有的模式生物中实现基因的定点敲除和编辑，涵盖人类体外培养细胞、斑马鱼、小鼠、大鼠、果蝇、秀丽隐杆线虫、水稻、拟南芥、烟草等多种物种［5，12］。在海洋生物中也已有多种生物成功运用该技术，其中包括玻璃海鞘、海胆、海葵、大西洋角螺、海七鳃鳗、大西洋鲑、端足类动物、脊尾白虾、三角褐指藻的种类较为广泛，涵盖了尾索动物、棘皮动物、刺胞动物、贝类、圆口纲、鱼类、甲壳动物和藻类等生物类群［15］。

大型海藻作为重要的自然资源，其可食用、可作饲料、工业原料和有机肥料，是具有较高价值的商品。许多海区大规模养殖大型海藻，这就对大型海藻的良种选育提出了更高的要求，而CRISPR／Cas9 基因编辑的运用对其精确育种有着重要的实践意义。随着大型海藻基因组测序工作的进一步进行，在海洋大藻中迫切需要建立简单高效的基因编辑系统，用于研究其基因功能。目前CRISPR／Cas9没有在大型海藻中的运用实例，包括褐藻的代表物种海带、红藻的代表物种紫菜等。与其他模式物种相比，在藻类中的运用起步较晚，还有一些技术问题有待解决，但CRISPR／Cas9 基因编辑技术与其他基因编辑技术相比，拥有无可比拟的优势和运用前景，是研究基因功能的强大工具。